24
diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37
o
C dengan aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan
jumlahnya cukup untuk penelitian. b.
Panen sel HeLa. Setelah jumlah sel cukup, media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara
diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifuse 2010
xG selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer.
Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3x10
4
100 μl dan siap dipakai untuk penelitian.
7. Preparasi Sel Vero
a. Propagasi sel Vero. Sel diambil dari nitogen cair, segera dicairkan dalam
penangas air 37º C, kemudian ampul disemprot dengan etanol cair 70. Ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung steril yang berisi medium M199.
Suspensi sel disentrifuse 2010 xG selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti M199 baru, disuspensikan pelan-pelan. Suspensi sel disentrifuse lagi 2010 xG selama 5
menit, cuci ulang, supernatan dibuang. Sel ditambah 1ml medium pertumbuhan yang mengandung 10 PBS dan diresuspensikan sehingga homogen. Kemudian sel
ditumbuhkan dalam beberapa buah tabung biakan kecil, diinkubasikan dalam inkubator aliran 5 CO
2
. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian lebih lanjut.
25
b. Panen sel Vero. Setelah jumlah sel cukup siap panen, sel dicuci dengan
fBS satu kali sebanyak 3 ml. Kemudian diberi tripsin 0,25 sebanyak 1ml untuk melepaskan sel-sel. Setelah itu dituang dalam conical steril yang sudah berisi M199
sebanyak 7 ml, bilas dengan 3ml FBS 10. Hasil bilasan dituang ke conical yang sama, sentrifuse 2010 xG selama 5 menit. Sel dicuci 1x lagi dengan menggunakan
medium yang sama untuk menghilangkan sisa tripsin. Pelet ditambah media kultur sebanyak 1ml, dihitung jumlah selnya dengan menggunakan haemocytometer.
Suspensi sel ditambah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3x10
4
sel100µl dan siap digunakan.
8. Uji sitotoksisitas fraksi protein umbi rumput teki
a. Sel HeLa. Sebanyak 100
μl suspensi sel HeLa dengan kepadatan 3x10
4
100 μl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang telah berisi
100 μl fraksi protein umbi teki dengan kadar 200 µgml pada sumuran A
1
, B
1
dan C
1
pada kolom 1, kemudian pada sumuran A
2
, B
2
dan C
2
di kolom 2 ditambahkan 100 μl suspensi sel HeLa pada sumuran yang telah berisi 100 μl fraksi protein umbi
rumput teki dengan kadar 100 µgml, demikian seterusnya hingga diperoleh seri kadar yang terendah yang digunakan dalam penelitian. Kemudian diinkubasi
bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi pembacaan dilakukan 3 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 6 baris sumuran. Sebagai
kontrol, 100 µl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 , sedangkan untuk faktor koreksi,
100 µl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
