29
dapat mempengaruhi hasil penelitian. Alat-alat tersebut dikumpulkan, dicuci bersih dengan sabun, dikeringkan, dan dibungkus dengan alumunium foil kemudian
disterilisasi. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121
C. Prinsip kerja autoklaf adalah menggunakan uap panas bertekanan yang dapat menyebabkan koagulasi dan denaturasi protein pada bakteri.
D. Preparasi Sampel Fraksi Protein Umbi Rumput Teki
Senyawa uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah fraksi protein umbi rumput teki. Umbi rumput teki segar yang telah dipanen dicuci bersih dengan air
mengalir untuk menghilangkan berbagai pengotor yang kemungkinan besar masih menempel. Umbi rumput teki kemudian dipotong kecil-kecil dan disimpan dalam
freezer semalaman yang dimaksudkan untuk mempermudah penumbukan bahan.
Sebanyak 400 g umbi rumput teki ditumbuk halus dalam mortir diatas wadah berisi es dengan penambahan sesedikit mungkin larutan dapar natrium fosfat 5 mM yang
mengandung NaCl. Dapar ini berfungsi untuk mengekstraksi protein dari selnya dan NaCl berfungsi untuk mempermudah proses ekstraksi dan melarutkan protein serta
membuatnya stabil dalam buffer pengekstrak. Semua proses dilakukan pada suhu rendah ±4ºC untuk mencegah denaturasi dan reaksi enzim proteolisis yang dapat
merusak protein umbi. Selanjutnya, bahan diperas menggunakan kain monel dan cairan yang diperoleh disentrifugasi 2010 xG selama 20 menit. Dari proses
sentrifugasi diperoleh supernatan yang merupakan ekstrak gubal umbi rumput teki. Protein dalam ekstrak gubal umbi rumput teki selanjutnya diendapkan
secara bertingkat dengan amonium sulfat lampiran 2. Penambahan amonium sulfat PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
dilakukan sedikit demi sedikit sambil terus diaduk dengan pengaduk stirer magnetik untuk menghindari amonium sulfat terkonsentrasi pada satu tempat.
Sebanyak 74,6 g amonium sulfat ditambahkan untuk 700 ml ekstrak gubal umbi rumput teki untuk mendapatkan FP
20
. Proses dilanjutkan dengan stirer semalaman agar terjadi keseimbangan antara larutan dan agregat protein. Didapatkan 700 ml
supernatan yang kemudian ditambah 74,2 g amonium sulfat untuk mendapatkan FP
40
. Dengan proses yang sama, didapat 720 ml supernatan yang kemudian ditambah
87,22 g amonium sulfat untuk mendapatkan FP
60
. Terakhir, FP
80
didapat dengan menambahkan 98,8 g amonium sulfat pada 760 ml supernatan. Semua proses
pengendapan bertingkat ini dilakukan pada suhu ±4ºC. Protein dapat mengendap karena adanya garam konsentrasi tinggi yang
bersifat lebih mudah larut dibanding protein, pada lingkungan dimana protein berada. Adanya amonium sulfat yang bersifat polar akan berinteraksi dengan bagian polar
dari protein dan menarik air yang terikat pada protein. Akibatnya, bagian non polar dari protein akan bergabung membentuk agregat yang tidak larut dalam air sehingga
protein akan mengendap saat sentrifugasi. Mekanisme ini dikenal dengan nama salting out
. Dalam setiap tingkat fraksi protein, endapan yang diperoleh dilarutkan
dengan sesedikit mungkin dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 tanpa NaCl kemudian didialisis. Proses dialisis dilakukan dengan tujuan pemurnian protein untuk
menghilangkan amonium sulfat. Masing-masing fraksi protein dimasukkan pada tubing dialysis
yang merupakan membran semi permeabel dan direndam dalam larutan dapar natrium fosfat 5 mM pH 7,2 dalam sebuah Beaker glass. Proses dialisis
