Isolasi Kapang Endofit Mikroba Endofit

8 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.2.2 Isolasi Kapang Endofit

Prosedur untuk mengisolasi kapang endofit pada umumnya relatif mudah. Salah satu hal yang penting dalam mengisolasi kapang endofit adalah mempertahankan kesegaran sampel. Bila sampel disimpan dalam waktu yang cukup lama, akan terjadi kematian jaringan. Meskipun demikian, masih memungkinkan untuk mengisolasi sejumlah kapang endofit dari jaringan yang telah layu setelah penyimpanan beku Freezing dalam waktu lebih dari satu tahun Wahyudi, 1997. Isolasi dimulai dengan melakukan sterilisasi permukaan. Pada umumnya, untuk sterilisasi permukaan organ tumbuhan dengan cara merendamnya dalam alkohol 70-95. Akan tetapi, kemampuan alkohol untuk mensterilkan permukaan organ tumbuhan tersebut mempunyai spektrum yang sempit atau sangat terbatas sehingga perlu dikombinasi dengan bahan kimia lainnya, dan biasanya sering dikombinasikan dengan 5,3 larutan Natrium Hipoklorit NaOCl. Di samping itu, bahan kimia yang bersifat sebagai oksidan, seperti H 2 O 2 3 dan KMnO 4 2 juga dapat dipakai untuk mensterilkan permukaan organ tumbuhan Zang et al., 2006. Etanol merupakan derivat alkohol yang efektif dan dapat diandalkan untuk sterilisasi dan disinfeksi. Natrium Hipoklorit adalah klorin yang paling banyak dipakai untuk disinfeksi dan menghilangkan bau, karena bersifat relatif tidak membahayakan bagi jaringan manusia, mudah ditangani, tidak berwarna dan tidak mewarnai, meskipun dapat memudarkan warna Block SS, 1977 dan Chatim et al., 1993. Sterilisasi dilakukan dengan cara mencuci tanaman yang masih segar dengan air mengalir selama 10 menit. Setiap sampel dipotong menjadi potongan- potongan kecil berukuran 1 cm, selanjutnya disterilisasi dengan cara merendamkan ke dalam etanol dan NaOCl dan terakhir dibilas kembali dengan etanol selama setengah menit Wahyudi, 1997. Proses isolasi selanjutnya dilakukan dengan metode tanam langsung yaitu setelah perendaman berakhir pada etanol selama setengah menit, potongan sampel dibiarkan kering di udara dalam Laminar Air Flow dan diletakkan di atas kertas tisu steril. Potongan-potongan kecil tersebut kemudian diletakkan di atas media seperti Corn Meal Malt Agar CMMA dan Nutrient Agar NA dengan posisi 9 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta permukaan belahan menempel pada agar medium. Tiap cawan petri bersisi 4 potongan 1, 2, 3 dan 4 Wahyudi, 1997. Pemilihan medium tumbuh pada tahap pertama isolasi mungkin juga akan sangat berpengaruh terhadap jumlah dan jenis kapang endofit yang akan terisolasi. Sebagai contoh, pada proses isolasi kapang endofit dari tanaman teh yang menggunakan medium Corn Meal Malt Agar CMMA dengan antibiotik kloramfenikol telah dilaporkan hanya 6 jenis kapang endofit yang berhasil diperoleh Agusta et al., 2006. Namun, pada proses isolasi kapang endofit dari tanaman teh dengan menggunakan medium dari agar tanpa penambahan antibiotik memberikan dua jenis kapang yang sama sekali berbeda dengan yang diperoleh dari proses isolasi dengan medium CMMA dan antibiotik. Pada medium agar, khamir memperlihatkan pertumbuhan yang lambat sehingga dapat digunakan untuk purifikasi isolat kapang filamen yang tercampur dengan khamir Agusta et al., 2006. Pembiakan isolat mikroba endofit membutuhkan waktu yang bervariasi. Isolasi kapang endofit membutuhkan waktu yang relatif lama kurang lebih 5 sampai 21 hari diinkubasi pada suhu ruang 27-29°C. Waktu inkubasi yang cukup lama ini disebabkan bahwa kebanyakan kapang endofit mempunyai sifat sebagai mikroorganisme lambat tumbuh Wahyudi, 1997. Zhang et al., 2006 merekomendasikan bahwa kapang endofit akan mulai tumbuh pada minggu kedua setelah inkubasi dan kapang yang tumbuh sebelum waktu tersebut kemungkinan besar adalah kontaminan. Namun, perlu diingat bahwa medium yang digunakan selama proses isolasi adalah medium yang kaya akan nutrisi sehingga sangat mungkin untuk mempercepat pertumbuhan kapang endofit. Pada medium yang kaya akan nutrisi seperti CMMA dan PDA, pada hari ketiga atau keempat sudah terlihat adanya kapang endofit yang tumbuh. Sementara pada medium yang relatif miskin nutrien, seperti medium agar, membutuhkan waktu 1 sampai 2 minggu untuk pemunculan koloni kapang. Untuk itu, cara yang paling rasional untuk mengidentifikasi kontaminan adalah dengan melakukan isolasi kapang endofit berulang kali paling tidak 3 kali Agusta et al., 2006. 10 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.2.3 Fermentasi Mikroba Endofit