30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.7 Cek kemurnian Bakteri Uji
Pengamatan bakteri uji dilakukan baik secara makroskopik dan mikroskopik. Pengamatan makroskopik bakteri uji dilakukan dengan mengamati
morfologi dan pertumbuhan koloni, meliputi bentuk, warna, dan bagian tepi koloni Handayani, 2007.
Pengamatan mikroskopis dilakukan dengan metode pewarnaan Gram. Langkah metode pewarnaan Gram adalah sebagai berikut : preparat uji dioleskan
bakteri setipis mungkin, kemudian difiksasi dengan cara dilewatkan di atas nyala api sebentar untuk melekatkan bakteri. Preparat tersebut diwarnai dengan larutan
kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir selama 5 detik. Kemudian diteteskan larutan lugol diatas preparat biarkan selama 1 menit,
dicuci kembali dengan air mengalir. Preparat kemudian diteteskan dengan etanol 96 selama 30 detik sampai tidak ada lagi zat warna lugol, lalu dicuci kembali
dengan air mengalir. Preparat diteteskan larutan safranin selama 10-30 detik, kemudian dicuci kembali dengan air mengalir, dikeringkan dengan cara
diletakkan di atas kertas saring. Preparat diamati dengan mikroskop cahaya perbesaran 1000 kali Handayani, 2007. Pengamatan mikroskopis meliputi
bentuk dan warna bakteri. Jika sel berwarna ungu berarti bakteri uji termasuk bakteri Gram positif. Tetapi jika sel berwarna merah berarti bakteri uji termasuk
bakteri Gram negatif.
3.3.8 Uji Aktivitas Antibakteri
3.3.8.1 Peremajaan Bakteri Uji
Bakteri uji, yaitu Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis
ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 8739, dan Shigella dysenteriae ATCC 13313 diremajakan pada medium NA miring. Bakteri uji diinokulasi sebanyak
satu ose ke dalam medium NA miring dan diinkubasi pada suhu 35°C selama 24
jam. Pengerjaan dilakukan dalam kondisi steril di dalam Laminar Air Flow Radji,
2006.
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.8.2 Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji
Kurva pertumbuhan dibuat pada masing-masing bakteri uji untuk menentukan fase log dari bakteri yang akan diuji, yaitu pada saat tercapainya
kecepatan pertumbuhan tertinggi. Biakan bakteri uji yang tumbuh pada agar miring NA ditambahkan dengan 5 mL NaCl 0.9 steril. Sebanyak 0,1 vv
suspensi bakteri dimasukkan ke dalam 100 mL medium NB kemudian dilakukan perhitungan absorbansi pada panjang gelombang 600 nm. Kuvet dibersihkan
kemudian diukur absorban awal NB steril sebagai kontrol dan NB yang mengandung bakteri pada menit ke-0 t
. Setelah absorban awal ditentukan, media NB diinkubasi pada pengocokan 120 rpm pada suhu 37°C. Setiap interval
30 menit dilakukan pengukuran absorban untuk mendapatkan kurva pertumbuhan Khotimah, 2010.
3.3.8.3 Uji Aktivitas Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar dengan cakram atau dikenal sebagai metode Kirby-Baurer Sinaga et al., 2009.
Biakan bakteri dalam NB dipipet 1 mL dimasukkan secara aseptis dalam cawan petri steril kemudian ditambahkan media MHA sejumlah ± 10 mL. Suspensi
bakteri yang telah diberi agar dalam cawan petri digoyangkan perlahan 10 kali ke kanan dan 10 kali ke kiri untuk memperoleh suspensi bakteri yang tersebar
merata pada media agar Rachmayani, 2008. Larutan uji kapang endofit diambil sebanyak 20 µL dan larutan uji
diserapkan pada kertas cakram steril. Cakram dibiarkan kering, kemudian diletakkan secara aseptis pada permukaan media yang telah berisi bakteri uji
Atika, 2007. Kontrol positif yang digunakan yaitu cakram antibiotik kloramfenikol.
Cakram antibiotik kloramfenikol diletakkan secara aseptis pada permukaan media uji. Kontrol negatif yang digunakan yaitu aquades steril. Sebanyak 20 µL larutan
kontrol negatif diserapkan ke cakram steril. Cakram yang sudah diresapi larutan kontrol negatif diletakkan secara aseptis pada permukaan media uji Atika, 2007.
Media diinkubasi pada suhu 35°C selama 24 jam. Isolat kapang yang memiliki aktivitas antibakteri akan menunjukkan zona hambat pada sekeliling
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
cakram. Zona hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong Rachmayani, 2008.
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil dan Pembahasan 4.1.1 Isolasi Kapang Endofit
Penelitian mikrobiologi yang bertema seleksi kapang endofit penghasil senyawa antibakteri dilakukan untuk mengetahui aktivitas isolat kapang endofit
yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap beberapa bakteri patogen. Secara garis besar ada 6 tahap dalam penelitian ini, yaitu isolasi kapang endofit,
pemurnian isolat kapang endofit, seleksi isolat kapang endofit yang berpotensi sebagai antibakteri, karakterisasi, fermentasi, dan uji aktivitas antibakteri terhadap
beberapa bakteri patogen. Kapang endofit diisolasi dari tanaman genus Medinilla speciosa Blume.
Tanaman ini diperoleh dari Gunung Muria, Desa Colo Kecamatan Dawe Kabupaten Kudus, Jawa Tengah pada tanggal 12 Januari 2015. Pada penelitian
sebelumnya, ekstrak etil asetat buah Medinilla specciosa Blume pada konsentrasi 200 mgmL, 100 mgmL, 50 mgmL, 25 mgmL, dan 12,5 mempunyai aktivitas
dengan diameter hambat 17,67 mm; 16,3 mm; 15,67 mm; 14,67 mm; 13,33 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan 12,33 mm; 11,33 mm; 10,67 mm; 9
mm; 8 mm terhadap bakteri Escherichia coli Niswah, 2014. Medinilla speciosa Blume merupakan genus tanaman yang tumbuh pada
lingkungan yang khas serta memiliki sejarah etnobotani yang banyak digunakan sebagai obat tradisional. Hal ini disebabkan Parijoto mengandung flavonoid,
tanin, saponin, kardenolid, terpenoid, dan glikosida dimana senyawa-senyawa tersebut diketahui sebagai senyawa yang mempunyai aktivitas farmakologi
sebagai antibakteri. Secara empiris tanaman Parijoto digunakan sebagai obat penyakit diare, sariawan, antiradang, dan antibakteri Anonim, 2014.
Beberapa tumbuhan dapat mentransfer senyawa bioaktif yang dikandung kepada mikroba endofit yang tumbuh dalam jaringan tanaman, sehingga mikroba
endofit tersebut mampu menghasilkan senyawa bioaktif yang karakternya mirip atau sama dengan inangnya. Hal ini disebabkan karena adanya koevolusi atau
Kategori