28
28 K
PM = A x B x C
Dimana : PM = populasi mikrob cfumL K
= jumlah koloni A
= volume inokulasi dalam media pengencer mL B
= pada pengenceran keberapa koloni mikrobnya dihitung C
= volume inokulasi dari media pengencer ke media padat mL Waktu yang diperlukan mikrob untuk membelah menjadi 2 sel baru disebut
waktu generasi Fardiaz 1992. Penentuan waktu generasi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Log x
1
– log x k =
0,301 . t Dimana : k = konstanta kecepatan pertumbuhan jumlah generasiwaktu
x = jumlah sel awal
x
1
= jumlah sel setelah waktu t t
= waktu x
1
– x 1k = waktu generasi
4. Pengujian Aktivitas Antagonistik atau Konfrontasi terhadap Mikrob Patogen
Pengujian aktivitas antagonistik atau konfrontasi dengan mikrob patogen dilakukan dengan metode sumur agar, yang mengacu pada metode menurut Wolf
dan Gibbons et al. 1996 dengan modifikasi suhu yang digunakan. Produksi antimikrob dilakukan dengan cara menginokulasi isolat mikrob
sebanyak 0,1 mL ke dalam 10 mL media TSB dan diinkubasi pada suhu 29
o
C selama waktu optimum waktu optimum diperoleh dari fase eksponensial
pertumbuhan mikrob, kemudian disentrifius dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang diperoleh disaring filtrasi dengan
menggunakan millipore 0,22 µm dan filtrat digunakan dalam konfrontasi dengan bakteri patogen uji untuk menentukan dihasilkan atau tidaknya antimikrob.
Mikrob patogen uji yang digunakan adalah mikrob patogen terhadap ikan, yaitu dari strain Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, dan Vibrio harveyi.
Mikrob patogen uji yang telah disegarkan diambil sebanyak 0,2 mL dan dimasukkan ke dalam media TSA dan dicampur hingga homogen. Setelah media
yang berisi biakan mikrob patogen memadat dibuat sumur lubang dengan ujung
29
29 pipet Pasteur dengan diameter 0,6 mm. Substrat antimikrob filtrat diteteskan ke
dalam lubang sebanyak 0,05 mL. Selanjutnya, cawan diinkubasi pada suhu 29
o
C selama 24 jam. Mikrob yang ma mpu menghasilkan substansi antimikrob akan
melakukan penghambatan terhadap bakteri patogen yang dibuktikan dengan adanya zona bening di sekitar sumur agar. Besarnya aktivitas antimikrob
ditentukan dengan cara mengukur diameter zona bening di sekitar sumur agar.
5. Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Garam Empedu
Ketahanan isolat mikrob terhadap asam lambung dan garam empedu digunakan untuk mengkaji kemampuannya bertahan dalam lambung dan saluran
pencernaan yang ber-pH rendah serta garam empedu di bagian atas usus. Pengujian dilakukan menurut metode Ngatirah et al. 2000. Metode ini
dilakukan dengan menginokulasi 1,0 mL isolat mikrob ke dalam satu seri tabung yang berisi 9 mL larutan media steril pada pH 2,5 pH diatur dengan
penambahan HCl dan pH 7,5 pH diatur dengan penambahan NaOH, kemudian diinkubasi pada suhu 29°C. Pengamatan dilakukan setelah 2, 4, 6, dan 8 jam
setelah inokulasi dan jumlah mikrob dihitung dengan metode hitungan cawan. Ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu ditentukan berdasarkan
jumlah koloni yang tumbuh pada kontrol dan perlakuan. Semakin kecil selisih semakin tahan mikrob yang diuji terhadap asam lambung dan garam empedu.
6. Uji Penempelan
