29
29 pipet Pasteur dengan diameter 0,6 mm. Substrat antimikrob filtrat diteteskan ke
dalam lubang sebanyak 0,05 mL. Selanjutnya, cawan diinkubasi pada suhu 29
o
C selama 24 jam. Mikrob yang ma mpu menghasilkan substansi antimikrob akan
melakukan penghambatan terhadap bakteri patogen yang dibuktikan dengan adanya zona bening di sekitar sumur agar. Besarnya aktivitas antimikrob
ditentukan dengan cara mengukur diameter zona bening di sekitar sumur agar.
5. Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Garam Empedu
Ketahanan isolat mikrob terhadap asam lambung dan garam empedu digunakan untuk mengkaji kemampuannya bertahan dalam lambung dan saluran
pencernaan yang ber-pH rendah serta garam empedu di bagian atas usus. Pengujian dilakukan menurut metode Ngatirah et al. 2000. Metode ini
dilakukan dengan menginokulasi 1,0 mL isolat mikrob ke dalam satu seri tabung yang berisi 9 mL larutan media steril pada pH 2,5 pH diatur dengan
penambahan HCl dan pH 7,5 pH diatur dengan penambahan NaOH, kemudian diinkubasi pada suhu 29°C. Pengamatan dilakukan setelah 2, 4, 6, dan 8 jam
setelah inokulasi dan jumlah mikrob dihitung dengan metode hitungan cawan. Ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu ditentukan berdasarkan
jumlah koloni yang tumbuh pada kontrol dan perlakuan. Semakin kecil selisih semakin tahan mikrob yang diuji terhadap asam lambung dan garam empedu.
6. Uji Penempelan
Uji penempelan atau adhesi dilakukan dengan metode menurut Dewanti dan Wong 1993, yaitu menggunakan lempeng stainless steel. Sebelum digunakan,
lempeng terlebih dahulu dibersihkan dari kotoran yang menempel pada permukaannya dengan cara merendam dalam larutan detergen panas 40 sampai
45°C selama 24 jam. Lempeng itu kemudian dibilas dengan air panas 40 sampai 50°C hingga tidak berbusa dan licin, lalu dikeringanginkan. Setelah pencucian
selesai, pada salah satu bagian sisi lempeng diberi tanda, dan selanjutnya disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121°C selama 20 me nit.
Pengujian dilakukan dengan cara meletakkan lempeng di dalam 250 mL media pertumbuhan yang diinokulasi dengan 1 mL kultur mikrob ke dalam
erlenmeyer 1L, kemudian diinkubasi pada suhu 29°C selama 24 jam. Densitas
30
30 biofilm dianalisis setelah 24 jam dengan cara membilas lempeng dengan larutan
buffer fosfat BF. Kemudian, dengan menggunakan swab permukaan lempeng diseka secara merata. Swab dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 10 mL BF
dan tabung divorteks selama 1 menit. Selanjutnya dilakukan kultur mikrob dan jumlah mikrob yang tumbuh dihitung dengan metode hitungan cawan dan
dinyatakan dalam cfucm
2
, setelah diinkubasi pada suhu 29°C selama 24 jam. Jumlah mikrob yang tumbuh pada fase cair juga dihitung dengan cara
mengambil 1 mL cairan dari media pertumbuhan dan diencerkan ke dalam 9 mL larutan BF. Kemudian dilakukan kultur mikrob dan jumlah mikrob dihitung
dengan metode hitungan cawan dan dinyatakan dalam cfumL, setelah diinkubasi pada suhu 29°C selama 24 jam.
Analisis Data
Data yang diperoleh pada percobaan isolasi dan seleksi mikroflora dari saluran pencernaan ikan bandeng dianalisis secara deskriptif. Mikrob yang
terseleksi digunakan sebagai kandidat probiotik dan materi pada penelitian selanjutnya.
Hasil Isolasi Mikrob
Pada penelitian ini berhasil diisolasi 18 isolat dari saluran pencernaan ikan bandeng yang terdiri atas 4 isolat mikrob amilolitik aerob, 3 isolat mikrob
amilolitik anaerob, 5 isolat mikrob proteolitik aerob, 2 isolat mikrob proteolitik anaerob, 2 isolat mikrob lipolitik aerob, dan 2 isolat mikrob lipolitik anaerob.
Morfologi koloni isolat dan jenis mikrob berdasarkan identifikasi secara fisiologi dan biokimia menggunakan Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Holt
et al. 1994 dapat dilihat pada Lampiran 14 dan bentuk isolat dapat dilihat pada Gambar 4.
31
31
Keterangan : Mikrob amilolitik aerob Mikrob amilolitik anaerob
A1-a : Moraxella sp. A1-an : Staphylococcus sp.
A2-a : Aeromonas hydrophila A2-an : Flavobacterium sp.
A3-a : Citrobacter sp. A3-an : Vibrio sp.
A4-a : Carnobacterium sp.
Mikrob proteolitik aerob Mikrob proteolitik anaerob
P1-a : Streptococcus sp. P1-an : Vibrio alginoliticus
P2-a : Bacillus sp. P3-a : Micrococcus sp.
P4-a : Pseudomonas sp. P5-a : Proteus sp.
Mikrob lipolitik aerob Mikrob lipolitik anaerob
L1-a : Planococcus sp. L1-an : Kurthia sp.
L2-a : Plesiomonas sp. L2-an : Serratia sp.
Gambar 4. Bentuk isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan bandeng
32
32 Gambar 4. lanjutan
33
33 Gambar 4. lanjutan
Seleksi Mikrob Mikrob Fakultatif
Pengujian fakultatif memberikan gambaran tentang keadaan lingkungan tempat mikrob tersebut dapat hidup. Faktor lingkungan yang paling menentukan
proses metabolisme energi yang dilakukan mikrob adalah oksigen. Hasil pengujian fakultatif menumbuhkan isolat mikrob aerob dalam media anaerob, dan
sebaliknya menumbuhkan isolat mikrob anaerob dalam media aerob disajikan pada Tabel 2. Dari 18 isolat yang diuji ditemukan 13 jenis isolat yang fakultatif,
yaitu golongan mikrob yang dapat tumbuh tanpa atau dengan adanya oksigen. Isolat fakultatif tersebut terdiri atas 8 isolat yang berasal dari mikrob aerob A1-a,
A2-a, A4-a, P1-a, P2-a, P3-a, L1-a dan L2-a dan 5 isolat yang berasal dari anaerob A1-an, A2-an, A3-an, P1-an dan L1-an. Isolat A3-a, P4-a dan P5-a
tergolong mikrob aerob, yaitu hanya dapat tumbuh jika terdapat oksigen di lingkungannya. Isolat P2-an dan L2-an tergolong mikrob anaerob, yaitu tidak
34
34 memerlukan oksigen untuk pertumbuhannya. Pertumbuhan mikrob ini biasanya
terhambat dengan adanya oksigen. Bahkan, beberapa jenis mikrob sangat sensitif dan akan mati jika ada oksigen.
Tabel 2. Isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik yang ditumbuhkan pada media aerob dan anaerob
Isolat Media aerob
Media anaerob Kriteria
Aerob A1-a
+ +
Fakultatif A2-a
+ +
Fakultatif A3-a
+ -
Aerob A4-a
+ +
Fakultatif P1-a
+ +
Fakultatif P2-a
+ +
Fakultatif P3-a
+ +
Fakultatif P4-a
+ -
Aerob P5-a
+ -
Aerob L1-a
+ +
Fakultatif L2-a
+ +
Fakultatif Anaerob
A1-an +
+ Fakultatif
A2-an +
+ Fakultatif
A3-an +
+ Fakultatif
P1-an +
+ Fakultatif
P2-an -
+ Anaerob
L1-an +
+ Fakultatif
L2-an -
+ Anaerob
Keterangan: A = Mikrob amilolitik a = Aerob + = Tumbuh P = Mikrob proteolitik an = Anaerob - = Tidak tumbuh
L = Mikrob lipolitik
Aktivitas Amilolitik, Proteolitik, dan Lipolitik
Besarnya aktivitas amilolitik, proteolitik, dan lipolitik isolat mikrob ditunjukkan dengan melakukan pengukuran hidrolisis pati, kasein, dan lemak, uji
degradasi subsrat oleh mikrob, serta uji aktivitas enzim amilase, protease, dan lipase.
1. Hidrolisis Pati, Kasein, dan Lemak
