Aktivitas Enzim Amilolitik, Proteolitik, dan Lipolitik

37 37 isolat P2-a. Kemampuan degradasi substrat terbesar pada isolat mikrob lipolitik diperlihatkan oleh isolat L1-a, yang diikuti oleh isolat L1-an, dan terendah ditunjukkan oleh isolat L2-an dan L2-a . Nilai degradasi substrat isolat mikrob lipolitik yang sangat kecil, dibandingkan dengan nilai degradasi substrat isolat lainnya terjadi akibat perbedaan satuan substrat yang digunakan. Isolat mikrob amilolitik dan proteolitik menggunakan satuan mgL dan mikrob lipolitik menggunakan satuan mmol lemak.

3. Aktivitas Enzim Amilolitik, Proteolitik, dan Lipolitik

Hasil pengukuran aktivitas enzim amilase, protease, dan lipase yang dihasilkan oleh isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik dapat dilihat pada Gambar 8 dan Lampiran 17. Gambar 8. Aktivitas enzim amilase, protease, dan lipase IUmLmenit yang dihasilkan oleh isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik Aktivitas enzim amilase, protease, dan lipase yang dihasilkan Gambar 8 memperlihatkan nilai yang seiring dengan kemampuan degradasi mikrob. Nilai aktivitas enzim amilase berkisar antara 0,58 dan 0,77 IUmLmenit. Aktivitas tertinggi ditunjukkan enzim yang dihasilkan oleh isolat A3-a yang diikuti oleh isolat A2-a, A1-an, A2-an, A4-a, A1-a, dan terendah oleh isolat A3-an. Aktivitas enzim protease berkisar antara 0,44 dan 0,82 IUmLmenit. Aktivitas tertinggi diperlihatkan oleh isolat P1-an yang diikuti oleh isolat P1-a, P3-a, P5-a, P4-a, dan terendah oleh isolat P2-a. Aktivitas enzim lipase berkisar antara 0,13 dan 0,36 Aktivitas enzim IUmLmenit 38 38 IUmLmenit dengan aktivitas tertinggi pada enzim yang dihasilkan oleh isolat L1-a yang diikuti oleh isolat L1-an, L2-an, dan terendah L2-a . Fase Pertumbuhan Mikrob Hasil pengamatan nilai kerapatan optik Optical Density = OD disajikan pada Lampiran 18 dan hasil analisis jumlah koloni cfumL disajikan pada Lampiran 19. Kurva pertumbuhan yang dihasilkan selama 24 jam periode pengamatan Gambar 9 memperlihatkan bahwa setiap isolat mempunyai pola yang bevariasi, begitu juga dengan hasil analisis waktu generasi Tabel 3 juga memperlihatkan hasil yang berbeda. Fase pertumbuhan awal atau lag I pada isolat mikrob amilolitik umumnya terjadi antara 0 dan 2 jam, kecuali pada isolat A1-an 0 sampai 6 jam; fase logaritma atau eksponensial II terjadi antara 2 dan 14 jam A4-a, 2 dan 16 jam A2-a dan A3-an, 6 dan 16 jam A1-an, serta antara 2 dan 18 jam A1-a, A3-a, dan A2-a; fase III adalah fase statis atau tetap tercapai antara 14 dan 18 jam A4-a, 16 dan 20 jam A2-a, 16 dan 22 jam A1-an, 18 dan 20 jam A3 -an, 18 dan 20 jam A2-an, serta antara 18 dan 22 jam A1-a dan A3-a, fase IV adalah fase kematian atau stationer dicapai setelah 18 jam A4-a, 20 jam A2-a, A3-a, dan A2-an, dan 22 jam A1-an , A1-a, dan A3-a. Pada isolat mikrob proteolitik, fase pertumbuhan awal atau lag I tercapai antara 0 dan 2 jam P2-a, P3-a, dan P1-an serta antara 0 dan 4 jam P1-a, P4-a, dan P5-a; fase logaritma atau eksponensial II terjadi antara 2 dan 16 jam P2-a, P1-an, 2 dan 12 jam P3-a, 4 dan 16 jam P4-a, P5-a, serta antara 4 dan 18 jam P1-a; fase III adalah fase statis atau tetap, pada P1-a dan P1-an tidak ada fase III langsung fase IV, yaitu fase stationer, fase statis mikrob proteolitik yang lain tercapai antara 16 dan 20 jam P2-a dan P4-a, 12 dan 20 jam P3-a, serta antara 16 dan 18 jam P5-a; fase IV adalah fase kematian atau stationer dicapai setelah 16 jam P1-an, 18 jam P1-a dan P5-a, dan 20 jam P2-a, P3-a, dan P4-a. Pada isolat mikrob lipolitik, fase pertumbuhan awal atau lag I yang tercapai antara 0 dan 2 L1-a, 0 dan 4 jam L1-an, serta 0 dan 6 jam L2-a dan L2-an; fase logaritma atau eksponensial II terjadi antara 4 dan 18 jam L1-a, 6 dan 18 jam L2-a, 4 dan 14 jam L1-an, serta antara 6 dan 12 jam L2-an; fase III adalah fase statis atau tetap tercapai 39 39 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 Optical Density OD Jumlah koloni optical density A1 -a 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 Optical Density OD Jumlah koloni optical density A2 -a 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 Optical Density OD Jumlah koloni optical density A3 -a 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 Optical Density OD Jumlah koloni optical density A4 -a 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Optical Density OD Jumlah koloni optical density A1 -a n 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 Optical Density OD Jumlah koloni optical density A2-an Gambar 9. Kurva pertumbuhan isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV A1-a A2-a A3-a A4-a A1-an A2-an 40 40 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Optical Density OD Jumlah koloni optical density P1 -a 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Optical Density OD Jumlah koloni optical density P2 -a 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 Optical Density OD Jumlah koloni optical density P3 -a 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 Optical Density OD Jumlah koloni optical density P4 -a 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Optical Density OD Jumlah koloni optical density P5 -a 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Optical Density OD Jumlah koloni optical density A3 -a n Gambar 9. lanjutan I II III IV I II IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV A3-an P1-a P2-a P3-a P4-a P5-a 41 41 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 Optical Density OD Jumlah koloni optical density P1 -a n 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Optical Density OD Jumlah koloni optical density L2 -a 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Optical Density OD Jumlah koloni optical density L1 -a n 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 Optical Density OD Jumlah koloni optical density L2 -a n 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Periode pengamatan jam Jumlah koloni log10 cfumL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 Optical Density OD Jumlah koloni optical density L1 -a Gambar 9. lanjutan I II IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV P1-an L1-a L2-a L1-an L2-an 42 42 L1-an, serta antara 12 dan 18 jam L2-an; fase IV adalah fase kematian atau stationer dicapai setelah 20 jam L1-a dan L2-a, sedangkan pada L1-an dan L2- an setelah 18 jam Gambar 9. Waktu generasi atau waktu yang diperlukan mikrob untuk membelah menjadi 2 sel baru, pada isolat mikrob amilolitik berkisar antara 23,62 dan 45,44 menit. Waktu generasi terpendek ditunjukkan oleh isolat A3-a dan tertinggi oleh isolat A4-a. Pada isolat mikrob proteolitik, waktu generasi berkisar antara 22,93 dan 37,85 menit. Waktu generasi terendah ditunjukkan oleh isolat P3-a dan tertinggi oleh isolat P5-a. Waktu generasi isolat mikrob lipolitik berkisar antara 32,38 dan 46,35 menit. Waktu generasi terendah diperlihatkan oleh isolat L2-a dan tertinggi oleh isolat L1-an Tabel 3. Tabel 3. Waktu generasi mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik Isolat Waktu generasi menit Isolat Waktu generasi menit Aerob Anaerob A1-a 24,25 A1-an 27,16 A2-a 34,21 A2-an 31,40 A3-a 23,62 A3-an 39,89 A4-a 45,44 P1-an 36,35 P1-a 32,72 P2-an - P2-a 33,43 L1-an 46,35 P3-a 22,93 L2-an 33,52 P4-a 33,10 P5-a 37,85 L1-a 34,56 L2-a 32,38 Keterangan: A = Mikrob amilolitik P = Mikrob proteolitik L = Mikrob lipolitik Aktivitas Antagonistik atau Konfrontasi terhadap Mikrob Patogen Salah satu kriteria yang diinginkan pada isolat yang terpilih sebagai kandidat probiotik adalah bahwa mikrob tersebut mampu menghasilkan antimikrob sehingga mampu menekan pertumbuhan mikrob patogen dalam saluran pencernaan ikan. Hasil pengamatan aktivitas antagonistik terhadap mikrob patogen pada ikan, yaitu dari strain Aeromonas hydrophila, Escherichia coli dan Vibrio harveyi Tabel 4 menunjukkan bahwa dari 17 isolat yang diuji 43 43 hanya 5 isolat yang memperlihatkan aktivitas antagonistik. Isolat yang mempunyai aktivitas antagonistik menunjukkan adanya zona bening di sekitar sumur Gambar 10. Isolat tersebut adalah isolat mikrob amilolitik 3 isolat A4-a, A1-an, dan A2-an, 2 isolat dari mikrob proteolitik P2-a dan P1-an , dan tidak ditemukan aktivitas antagonistik pada isolat mikrob lipolitik. Isolat A4-a memperlihatkan zona penghambatan pada semua mikrob patogen uji, isolat A1-an hanya memperlihatkan zona penghambatan pada Escherichia coli, dan isolat A2-an hanya memperlihatkan zona penghambatan pada Vibrio harveyi. Zona penghambatan isolat P2-a hanya pada Escherichia coli, dan isolat P1-an memperlihatkan zona penghambatan pada 2 jenis mikrob patogen uji yaitu Escherichia coli dan Vibrio harveyi. Tabel 4. Aktivitas antagonistik atau konfrontasi isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik terhadap mikrob patogen pada ikan Isolat Aeromonas hydrophila Escherichia coli Vibrio harveyi K D D K D D K D D Aerob A1-a - - - A2-a - - - A3-a - - - A4-a + 12 mm 10 mm + 10 mm 11 mm + 10 mm 8 mm P1-a - - - P2-a - + 12 mm 9 mm - P3-a - - - P4-a - - - P5-a - - - L1-a - - - L2-a - - - Anaerob A1-an - + 8 mm 8 mm - A2-an - - + 12 mm 11 mm A3-an - - - P1-an - + 8 mm 9 mm + 16 mm 10 mm P2-an - - - L1-an - - - L2-an - - - Keterangan: A = Mikrob amilolitik K = Kriteria + Ada aktivitas antagonistik P = Mikrob proteolitik - Tidak ada aktivitas L = Lipolitik antagonistik D = Diameter 44 44 Gambar 10. Aktivitas antagonistik mikrob uji terhadap mikrob patogen bagi ikan Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, dan Vibrio harveyi VhA2an 45 45 Ketahanan terhadap Asam Lambung dan Garam Empedu Ketahanan isolat terhadap asam lambung dan garam empedu direfleksikan dengan kemampuannya bertahan dalam media asam dan basa, yang dinyatakan dalam penurunan log jumlah isolat dalam media kontrol dan perlakuan selama periode pengamatan. Hasil pengujian ketahanan isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik terhadap asam lambung dan garam empedu disajikan pada Lampiran 20. Selisih log jumlah isolat kontrol dan perlakuan setiap periode pengamatan disajikan pada Gambar 11. Kemampuan setiap isolat di dalam media pada pH asam dan pH basa bervariasi. Sampai jam ke-8, secara umum semua isolat masih hidup, walaupun tingkat pertumbuhan pada umumnya lebih rendah dari kontrol Gambar 11. Penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 2,5 periode pengamatan 2 jam ditunjukkan oleh isolat A1-a dan A4-a, diikuti oleh isolat A2-a, A1-an, A2-an, dan terbesar ditunjukkan oleh isolat A3-a, sedangkan isolat A3-an dengan populasi lebih tinggi dari kontrol. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi mikrob diperlihatkan oleh isolat P1- an, diikuti oleh isolat P5-a, P4-a, P3-a, P2-a, dan terbesar ditunjukkan oleh isolat P1-a . Pada isolat mikrob lipolitik penurunan log populasi mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L2-a, L1-an, L2-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat L1-a. Pada periode pengamatan 4 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 2,5 ditunjukkan oleh isolat A4-a, yang diikuti oleh isolat A1-a, A3-an, A3-a, A1-an, A2-an, dan tertinggi diperlihatkan oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi mikrob diperlihatkan oleh isolat P5-a, yang diikuti oleh isolat P4-a, P1-a, P3-a, P1-an, dan terbesar ditunjukkan oleh isolat P2-a . Pada isolat mikrob lipolitik, penurunan log populasi mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L1-a, L2-a, L1-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat L2-an . Pada periode pengamatan 6 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 2,5 diperlihatkan oleh isolat A4-a, yang diikuti oleh isolat A1-a, A3an , A3-a, A1-an, A2-an, dan tertinggi ditunjukkan oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat diperlihatkan 46 46 oleh isolat P4-a, yang diikuti oleh isolat P5-a, P1-an, P1-a, P3-a, dan terbesar ditunjukkan oleh isolat P2-a . Pada mikrob lipolitik, penurunan log populasi isolat mikrob terkecil diperlihatkan oleh isolat L2-a, L2-an, L1-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat L1-a. Gambar 11. Selisih log cfumL antara jumlah isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik dalam media dengan pH 2,5 dan pH 7,5 dengan kontrol setiap periode pengamatan Pada periode pengamatan 8 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 2,5 diperlihatkan oleh isolat A4-a, yang diikuti oleh isolat A1-a, A2-an, A1-an, A3-a, A3-an dan tertinggi oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat mikrob diperlihatkan oleh isolat P1-a, yang diikuti oleh isolat P3-a, P5-a, P4-a, P1-an, dan terbesar 47 47 diperlihatkan oleh isolat P2-a. Pada isolat mikrob lipolitik penurunan log populasi mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L2-a, L1-an, L2-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat L1-a. Penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 7,5 periode pengamatan 2 jam diperlihatkan oleh isolat A1-a, A2-an, A4-a, dan A2-a, sedangkan isolat A3-a , A1-an dan A3-an dengan populasi lebih tinggi dari kontrol. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi mikrob diperlihatkan oleh isolat P2-a, yang diikuti oleh isolat P5-a, sedangkan isolat yang lain dengan log populasi isolat sama atau lebih besar dari kontrol. Pada mikrob lipolitik, penurunan log populasi isolat terkecil diperlihatkan oleh isolat L2-a, L1-an dan terbesar ditunjukkan oleh isolat L1-a, adapun populasi isolat L2-an lebih besar dari kontrol. Pada periode pengamatan 4 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 7,5 ditunjukkan oleh isolat A1-an, yang diikuti oleh isolat A1-a, A4-a, A3-an, A3-a, A2-an, dan tertinggi diperlihatkan oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat mikrob diperlihatkan oleh isolat P4-a, yang diikuti oleh isolat P5-a, P1-a, P2-a, P3-an, dan terbesar diperlihatkan oleh isolat P1-an. Pada isolat mikrob lipolitik, penurunan log populasi isolat mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L1-a, L2-a, L1-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat L2-an. Pada periode pengamatan 6 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 7,5 diperlihatkan oleh isolat A1-an, yang diikuti oleh isolat A1-a, A2-a, A3-an, A3-a, A4-a, dan tertinggi diperlihatkan oleh isolat A2-a. Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat mikrob diperlihatkan oleh isolat P4-a, yang diikuti oleh isolat P3-a, P2-a, P1-a, dan terbesar diperlihatkan oleh isolat P5-a dan P1-an. Pada isolat mikrob lipolitik, penurunan log populasi isolat mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L1-a, L2-an, dan terbesar oleh isolat L1-an, sedangkan isolat L2-a mempunyai log populasi isolat yang sama dengan kontrol. Pada periode pengamatan 8 jam, penurunan log yang terkecil populasi isolat mikrob amilolitik pada pH 7,5 diperlihatkan oleh isolat A1-an, yang diikuti oleh isolat A1-a, A4-a, A2-an, A3-an, A2-a dan tertinggi ditunjukkan oleh isolat A3-a. 48 48 Pada isolat mikrob proteolitik, penurunan log terkecil populasi isolat mikrob diperlihatkan oleh isolat P3-a, yang diikuti oleh isolat P4-a, P2-a, P1-a, P1-an dan terbesar diperlihatkan oleh isolat P5-a. Pada isolat mikrob lipolitik, penurunan log populasi isolat mikrob terkecil ditunjukkan oleh isolat L1-a, L2-a, L2-an dan terbesar oleh isolat L1-an. Uji Penempelan Uji penempelan atau adhesi isolat mikrob didasarkan pada kemampuan mikrob membentuk biofilm, mikrob yang mampu membentuk biofilm dengan baik akan memiliki kemampuan menempel dengan baik pula. Hal ini diujikan sebagai pendekatan terhadap kemampuan menempel isolat pada substrat padat usus. Hasil uji penempelan pada lempeng stainless steel isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan bandeng Tabel 5 dan Lampiran 21 menunjukkan bahwa semakin tinggi populasi mikrob planktonik maka populasi mikrob yang menempel semakin rendah. Tabel 5. Hasil uji penempelan isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik pada lempeng stainless steel Isolat Populasi mikrob Isolat Populasi mikrob Swab Planktonik Swab Planktonik Aerob Anaerob A1-a 8,9 x 10 4 7,6 x 10 10 A1-an 7,1 x 10 5 8,1 x 10 9 A2-a 4,5 x 10 4 4.7 x 10 11 A2-an 5,0 x 10 4 4,2 x 10 11 A3-a 7,1 x 10 5 5,4 x 10 8 A3-an 8,4 x 10 4 9,3 x 10 10 A4-a 1,8 x 10 4 1,4 x 10 12 P1-an 1,6 x 10 5 2,8 x 10 10 P1-a 6,2 x 10 5 9,5 x 10 9 P2-an - - P2-a 6,7 x 10 4 4,2 x 10 10 L1-an 8,5 x 10 5 8,5 x 10 9 P3-a 7,2 x 10 4 1,2 x 10 11 L2-an 1,3 x 10 5 2,0 x 10 10 P4-a 4,2 x 10 4 7,9 x 10 11 P5-a 3,5 x 10 4 8,2 x 10 11 L1-a 5,7 x 10 4 4,0 x 10 11 L2-a 2,2 x 10 5 3,8 x 10 10 Keterangan: A = Mikrob amilolitik Populasi mikrob: Swab = cfucm 2 P = Mikrob proteolitik Planktonik = cfumL L = Mikrob lipolitik 49 49 Rekapitulasi Rekapitulasi hasil pengujian parameter seleksi isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik hasil isolasi dari saluran pencernaan ikan bandeng disajikan pada Tabel 6. Tabel 6. Rekapitulasi data hasil pengujian beberapa parameter yang digunakan pada seleksi isolat mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik saluran pencernaan ikan bandeng yang potensial sebagai kandidat probiotik Isolat Parameter F H D AE PM AG pH T Aerob A1-a + 14 1649,24 0,66 8,4 x 10 10 - + + A2-a + 16 1702,63 0,76 4,3 x 10 11 - + + A3-a - 14 1705,22 0,77 6,1 x 10 8 - + + A4-a + 15 1651,49 0,66 2,0 x 10 12 +3 + + P1-a + 15 1837,37 0,67 1,8 x 10 10 - + + P2-a + 12 1502,11 0,44 5,3 x 10 10 +1 + + P3-a + 13 1823,16 0,66 1,5 x 10 11 - + + P4-a - 14 1610,53 0,53 8,0 x 10 11 - + + P5-a - 16 1811,59 0,65 8,3 x 10 11 - + + L1-a + 10 0,21 0,36 4,4 x 10 11 - + + L2-a + 9 0,14 0,13 4,2 x 10 10 - + + Anaerob A1-an + 11 1694.1 0.76 8.5 x 10 9 +1 + + A2-an + 14 1651.82 0.62 4.1 x 10 11 +1 + + A3-an + 10 1582.92 0.58 1.4 x 10 11 - + + P1-an + 16 1918.95 0.82 6.7x 10 10 +2 + + P2-an - - - - - L1-an + 9 0.18 0.31 3.1 x 10 10 - + + L2-an - 10 0.16 0.21 1.7 x 10 10 - + + Keterangan : F = fakultatif , H = hidrolisis mm D = degradasi substrat mikrob amilolitik dan proteolitik: mgL, mikrob lipolitik: mmol lemak, AE = aktivitas enzim IUmLmenit, PM = populasi mikrob cfumL, AG = antagonistik, pH = ketahanan terhadap asam lambung dan garam empedu, dan T = uji penempelan adhesi 50 50 Pembahasan Mikroflora yang ditemukan pada saluran pencernaan ikan bandeng di antaranya adalah Moraxella sp., Aeromonas sp., Citrobacter sp., Carnobacterium sp., Streptococcus sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp., Plesiomonas sp., Staphylococcus sp., Flavobacterium sp., Vibrio sp., dan Serratia sp. Mikrob tersebut juga ditemukan pada saluran pencernaan spesies ikan lain dan media budi daya seperti dilaporkan oleh beberapa peneliti Sakata dan Yuki 1991; Cipriano et al. 1992; Sugita et al. 1994; Garcia et al. 1997; Rombout et al. 1999; Olsen et al. 2000; Rengpipat et al. 2000; Robertson et al. 2000; Spanggaard et al. 2000; dan Al-Harbi dan Uddin 2005. Namun demikian, belum ditemukan laporan tentang jenis mikrob lainnya yang ditemukan pada saluran pencernaan ikan bandeng, yaitu mikrob Micrococcus sp., Proteus sp., Planococcus sp., dan Kurthia sp. ditemukan pada saluran pencernaan spesies ikan lain. Akan tetapi, jenis mikrob tersebut umumnya ditemukan pada substrat tanah Pelczar dan Chan 1988; dan Olsen et al. 2000. Mikroflora saluran pencernaan ikan bandeng seperti halnya mikrob yang ditemukan pada spesies ikan lainnya diduga berasal dari lingkungan budi daya. Mikrob tersebut masuk ke dalam saluran pencernaan bersama dengan pakan yang dimakan. Khususnya ikan bandeng, kebiasaannya memakan detritus dari dasar tambak bertujuan untuk mendapatkan jasad renik atau mikroorganisme untuk memenuhi kebutuhan protein dan atau untuk membantu degradasi pakan yang dimakan. Dengan demikian, mikroflora tersebut mempunyai peluang yang besar untuk dijadikan probiotik. Mikroflora menguntungkan yang ditemukan pada saluran pencernaan ikan bandeng adalah Moraxella sp., Bacillus sp., Carnobacterium sp., Vibrio alginoliticus, Streptococcus sp., Pseudomonas sp., dan Flavobacterium sp. Hasil penelitian yang mempertegas hal ini dilaporkan oleh beberapa peneliti Garcia et al. 1997;. Haryanti et al. 1999; Rengpipat et al. 1998, 2000;. Rombout et al. 1999; De Schrijver dan Ollevier 2000; dan Robertson et al. 2000. Mikrob tersebut berperan sebagai nutrien tambahan bagi ikan dan atau suplemen dalam kultur pakan alami, yaitu bermanfaat melalui metabolit seperti vitamin B12 dan enzim yang disekresikannya ke dalam medium kultur. Di samping itu, mikrob 51 51 yang termakan dan masuk ke dalam saluran pencernaan berperan dalam meningkatkan kecernaan nutrien pakan melalui enzi m pencernaan eksogen yang disekresikannya. Peran yang lain adalah kemampuan mikrob menghasilkan senyawa antimikrob sehingga mampu menghambat perkembangan mikro patogen dalam saluran pencernaan ikan maupun media budi daya. Oleh karena itu, mikroflora saluran pencernaan ikan bandeng yang terpilih sebagai kandidat probiotik adalah mikrob yang menguntungkan serta dapat menjaga keseimbangan mikroflora dalam saluran pencernaan ikan. Salah satu tahapan seleksi adalah mikrob yang terpilih harus tergolong fakultatif. Hal ini demikian karena probiotik yang diaplikasikan dalam budi daya ikan bandeng akan berhadapan dengan 2 kondisi lingkungan yang sangat berbeda, yaitu ada dan tidak ada oksigen. Probiotik diinokulasikan ke dalam pakan pada kondisi lingkungan yang dipenuhi oksigen. Setelah pakan diberikan dan dimakan oleh ikan, mikrob masuk ke saluran pencernaan dan berhadapan dengan keadaan lingkungan anaerob, yaitu tidak ada oksigen. Keadaan lingkungan tempat mikroorganisme tersebut hidup sangat menentukan metabolisme energi yang dilakukannya. Menurut Fardiaz 1992 faktor lingkungan yang paling menentukan dalam metabolisme energi mikrob adalah oksigen. Mikroflora saluran pencernaan ikan bandeng yang tergolong mikrob fakultatif adalah Moraxella sp., Aeromonas hydrophila, Carnobacterium sp., Staphylococcus sp., Flavobacterium sp., Vibrio sp., Streptococcus sp., Bacillus sp., Micrococcus sp., Vibrio alginoliticus, Planococcus sp., Plesiomonas sp., dan Kurthia sp. Pada percobaan ini yang menjadi target isolasi adalah mikrob yang mempunyai aktivitas amilolitik, proteolitik, dan lipolitik. Ketiga golongan mikrob tersebut adalah mikrob yang mampu mensekresikan enzim yang berperan penting dalam proses pencernaan, yaitu sebagai katalisator dalam hidrolisis nutrien pakan pada saluran pencernaan ikan. Ketiga jenis enzim tersebut adalah amilase, protease, dan lipase. Mikroorganisme dapat menyesuaikan diri dengan lingkungan sekitar yang kaya akan molekul kompleks dengan cara mensekresikan enzim yang disebut eksoenzim. Eksoenzim menghidrolisis makromolekul menjadi molekul yang lebih sederhana, seperti protein menjadi asam amino, polisakarida menjadi gula, dan lemak menjadi asam lemak. Molekul yang sudah kecil ini diangkut ke 52 52 sitoplasma sehingga dapat digunakan sebagai sumber energi atau senyawa pemula dalam sintesis komponen sel Lay 1994. Mikrob amilolitik adalah mikrob yang mampu menghasilkan eksoenzim amilase yang akan mendegradasi zat pati menjadi maltosa dan glukosa. Sakarida ini diangkut ke dalam sitoplasma sel dan digunakan sebagai sumber karbon dan energi. Mikrob proteolitik adalah mikrob yang mampu menghasilkan eksoenzim protease yang akan merombak protein menjadi asam amino. Mikrob proteolitik akan memanfaatkan asam amino sebagai sumber karbon dan energi. Mikrob lipolitik adalah mikrob yang mampu menghasilkan eksoenzim lipase yang akan mencerna trigliserida dan menghasilkan asam lemak berantai panjang dan gliserol yang akan dimanfaatkan sebagai sumber karbon dan gliserol Atlas et al. 1984. Pada penelitian ini isolasi mikrob dilakukan secara selektif. Artinya bahwa isolasi langsung menggunakan media yang sesuai dengan kebutuhan nutrien mikrob yang menjadi target isolasi. Meskipun demikian, dilakukan juga tahapan pengujian degradasi atau hidrolisis substrat, serta aktivitas enzim amilase, protease, dan lipase untuk membuktikan bahwa mikrob yang telah diisolasi merupakan mikrob amilolitik, proteolitik, dan lipolitik. Kemampuan degradasi atau hidrolisis pati dan aktivitas enzim amilase pada mikrob ami lolitik dari yang tinggi ke rendah ditunjukkan oleh Citrobacter sp, Aeromonas hydrophila, Staphylococcus sp., Flavobacterium sp., Carnobacterium sp., Moraxella sp., dan Vibrio sp. Kemampuan degradasi atau hidrolisis kasein dan aktivitas enzim protease pada mikrob proteolitik dari yang tinggi ke rendah ditunjukkan oleh Vibrio alginoliticus, Streptococcus sp., Micrococcus sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., dan Bacillus sp. Kemampuan degradasi atau hidrolisis lemak dan aktivitas enzim lipase pada mikrob lipolitik dari yang tinggi ke rendah ditunjukkan oleh Planococcus sp., Kurthia sp., Serratia sp., dan Plesiomonas sp. Aktivitas enzim yang dihasilkan berkisar mulai dari 0,58 sampai 0,77 IU mLmenit untuk mikrob amilolitik, 0,44 samp ai 0,82 IUmLmenit untuk mikrob proteolitik, dan 0,13 sampai 0,36 IUmLmenit untuk mikrob lipolitik. Aktivitas enzim protease yang disekresikan Bacillus pumilus yang dihasilkan oleh Wijaya 1995 berkisar mulai dari 1,58 sampai 2,76 IUmLmenit atau 5 kali lipat 53 53 lebih tinggi dari enzim kasarnya. Enzim yang dihasilkan pada percobaan ini masih berupa crude enzyme enzim kasar sehingga berpengaruh pada aktivitas enzim yang dihasilkannya. Salah satu faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah kemurnian enzim. Walaupun demikian, kisaran nilai aktivitas crude enzyme yang diperlihatkan mikroflora saluran pencernaan ikan bandeng lebih besar kalau dibandingkan dengan kontribusi aktivitas enzim pencernaan yang berasal dari pakan alami. Haryati 2002 melaporkan bahwa aktivitas enzim-enzim yang terdeteksi pada Brachionus, yang akan memberi kontribusi terhadap aktivitas enzim di dalam saluran pencernaan adalah a-amilase 0,0694 ± 0,0134; lipase 0,0537 ± 0,0800; tripsin 0,0180 ± 0,0020; dan pepsin 0,0192 ± 0,0002 IU g Brachionusmenit. Oleh karena itu crude enzyme yang disekresikan oleh mikroflora saluran pencernaan ikan bandeng mempunyai potensi untuk diaplikasikan pada usaha pembenihan ikan bandeng untuk menghidrolisis predigestion pakan buatan sebelum diberikan pada larva. Istilah pertumbuhan untuk mikroorganisme mengacu pada perubahan di dalam hasil panen sel pertambahan total massa sel, dan bukan perubahan individu organisme. Cara khas reproduksi bakteri adalah pembelahan biner melintang, satu sel membelah diri menghasilkan dua sel, dan populasi akan bertambah secara geometrik. Pertumbuhan populasi sel pada umumnya terjadi pada fase logaritma atau eksponensial. Kandidat probiotik yang akan terpilih menjadi probiotik diharapkan mencapai fase eksponensial dengan cepat dengan waktu generasi yang pendek. Menurut Havenaar et al. 1992 mikrob yang terpilih sebagai probiotik agar dapat bertahan hidup dalam saluran pencernaan inang, harus mempunyai waktu generasi yang pendek dan atau kemampuan kolonisasi pada permukaan usus. Pengamatan pada fase pertumbuhan mikrob dilakukan dengan mengamati perubahan populasi dan nilai kerapatan optik Optical Density = OD untuk menunjukkan aktivitas mikrob dalam hubungannya dengan komposisi sel sendiri dan lingkungan. Pertumbuhan isolat mikrob diukur untuk menentukan fase-fase pertumbuhan dan waktu generasi. Hal ini berhubungan dengan panen sel yang tepat untuk memproduksi suatu produk atau senyawa metabolit, antara lain enzim, antimikrob, vitamin, asam organik, asam lema k, asam amino, dan peptida. 54 54 Fase pertumbuhan masing-masing isolat mikrob saluran pencernaan ikan bandeng dan waktu generasinya bervariasi antar-isolat. Hal ini mengindikasikan bahwa isolat yang diisolasi merupakan isolat mikrob yang berbeda. Berdasarkan fase pertumbuhan yang diperlihatkan oleh 3 kandidat probiotik terpilih, yaitu Carnobacterium sp., Vibrio alginoliticus, dan Planococcus sp., periode waktu inkubasi yang dilakukan untuk memproduksi crude enzyme atau senyawa antimikrob adalah pada fase eksponensial, yaitu 14 jam untuk Carnobacterium sp., 16 jam untuk Vibrio alginoliticus, dan 18 jam untuk Planococcus sp. Selain kriteria yang disebut di atas, kriteria isolat mikrob yang dipertimbangkan sebagai probiotik adalah kemampuannya untuk menghambat perkembangan mikrob patogen sehingga mampu berkompetisi untuk mempertahankan keseimbangan mikroflora normal dalam usus. Isolat yang menunjukkan aktivitas antagonistik terhadap mikrob patogen uji Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, dan Vibrio harveyi adalah Carnobacterium sp., Bacillus sp., Staphylococcus sp., Flavobacterium sp., dan Vibrio alginoliticus. Hasil yang didapat sesuai dengan beberapa hasil penelitian sebelumnya bahwa isolat-isolat tersebut mempunyai aktivitas antagonistik terhadap mikrob patogen bagi spesies ikan. Mikroflora yang telah diisolasi dari saluran pencernaan ikan bandeng tidak semuanya menguntungkan bagi ikan dan atau pakan alami ikan. Mikroflora yang merugikan atau mikrob patogen bagi ikan adalah Aeromonas hydrophila, Pseudomonas sp., Plesiomonas sp., Vibrio sp., dan Streptococcus sp. Keberadaan mikrob patogen pada saluran pencernaan ikan dan atau media budi daya dengan populasi yang tinggi sangat merugikan pada usaha budi daya ikan. Hal ini terjadi karena mikrob patogen dapat menimbulkan penyakit dan bahkan kematian bagi organisme budi daya. Hal penting yang diperlukan mikroflora saluran pencernaan adalah berada dalam keseimbangan, yaitu antara mikrob menguntungkan dan mikrob patogen, serta saling berinteraksi antar-spesies mikrob dalam saluran pencernaan, baik secara antagonistik maupun sinergistik. Interaksi yang terjadi sangat penting di dalam mempertahankan keseimbangan mikroflora saluran pencernaan. Kemampuan mikrob menguntungkan dalam menghambat perkembangan mikrob patogen, menunjukkan kemampuannya untuk 55 55 mempertahankan keseimbangan mikroflora di dalam saluran pencernaan ikan bandeng. Kemampuan tersebut berhubungan dengan kemampuannya menghasilkan senyawa antimikrob, yaitu peptida yang disintesis dalam ribosom. Surono 2004 mengemukakan bahwa antimikrob yang dihasilkan mikroflora di antaranya adalah asam laktat, peroksida, dan bakteriosin. Flora normal pada usus memiliki fungsi perlindungan yang penting untuk menekan bakteri patogen dan virus, menstimulir daya tahan lokal dan sistemik, serta mengubah aktivitas metabolik mikrob usus. Selain itu, mikrob probiotik juga menekan mikrob patogen karena terjadinya kompetisi sisi penempelan reseptor, peningkatan produksi lender atau mukosa usus, dan kompetisi nutrisi Salminen dan Wright 1993 Toleran pada asam lambung dan garam empedu merupakan syarat terpenting kandidat probiotik. Hal ini demikian karena, stres pertama yang terjadi pada sel mikrob yang memasuki saluran pencernaan adalah asam lambung. Selanjutnya setelah melewati lambung, sel mikrob akan berhadapan dengan garam empedu dengan pH basa di usus halus. Ketahanan isolat terhadap asam lambung dan garam empedu direfleksikan oleh ketahanannya pada media asam dan basa, yang dinyatakan dalam penurunan log jumlah isolat dalam media kontrol dan perlakuan selama periode pengamatan. Penurunan log yang terkecil menunjukkan ketahanan terhadap pH rendah dan pH tinggi yang terbesar. Mikrob yang berhasil bertahan pada kondisi pH rendah dinyatakan bersifat tahan atau resisten terhadap asam lambung, sedangkan mikrob yang berhasil hidup pada pH basa dinyatakan bersifat tahan atau resisten terhadap garam empedu Zavaglia et al. 1998; Chou dan Weimer 1999;. Kimono et al. 1999; dan Jacobsen et al. 1999. Mikroflora saluran pencernaan ikan bandeng yang diuji menunjukkan kemampuannya bertahan pada media asam dan basa. Hal ini mengindikasikan bahwa mikroflora tersebut mampu bertahan hidup pada lambung yang ber-pH rendah akibat sekresi asam lambung, dan juga mampu berhadapan dengan garam empedu yang ber-pH tinggi. Isolat tetap mampu hidup sampai pada akhir pengamatan 8 jam. Kemampuan tersebut diduga karena isolat tersebut adalah mikroflora normal saluran pencernaan yang sudah beradaptasi dengan kondisi asam lambung dan garam empedu dalam saluran pencernaan. 56 56 Toleransi terhadap perubahan keasaman media terjadi oleh kemampuan mikrob mengatur pH sitoplasma dibandingkan pH ekstraseluler Hutkins dan Nannen 1993. Untuk mempertahankan pH sitoplasma, sel mikrob harus mempunyai barier terhadap aliran proton. Barier ini umumnya adalah membran sitoplasma. Perbedaan kerentanan membran sitoplasma terhadap kondisi asam atau basa menentukan toleransi mikrob pada pH. Membran sitoplasma mikrob terdiri atas 2 lapis fosfolipid lipid bilayer. Di dalam dan pada permukaan lapisan tersebut melekat protein dan glikoprotein. Lipit bilayer bersifat semipermiabel yang merupakan barier yang membatasi pergerakan senyawa yang keluar masuk antara sitoplasma dan lingkungan luar Cano dan Colome 1986. Komposisi dan struktur asam lemak dan protein membran sitoplasma beragam di antara spesies mikrob. Keragaman tersebut mempengaruhi karakteristik dan permeabilitasnya sehingga berpengaruh pada ketahanan mikrob pada kondisi asam atau basa. Agar dapat bertahan hidup dalam saluran pencernaan inang, mikrob harus mempunyai waktu generasi yang pendek dan kemampuan kolonisasi pada permukaan usus. Hal ini disebabkan oleh strain yang tidak mempunyai kemampuan kolonisasi akan terlepas oleh kontraksi usus Havenaar et al. 1992. Agar dapat mengkolonisasi dengan baik pada permukaan saluran pencernaan, probiotik harus mempunyai kemampuan adhesi atau menempel. Adhesi dapat dipertimbangkan sebagai tahap pertama kolonisasi, dan sebanding dengan viabilitas dan aktivitas metabolik. Jenis mikrob yang berbeda mempunyai kemampuan penempelan yang berbeda pula. Berdasarkan pengujian adhesi pada mikroflora saluran pencernaan ikan bandeng yang berhasil diisolasi menunjukkan bahwa semakin tinggi populasi mikrob planktonik semakin rendah populasi mikrob yang menempel. Hubungan negatif ini diduga terjadi karena laju pertumbuhan yang tinggi pada populasi mikrob planktonik menyebabkan nutrien berkurang dengan cepat sehingga sel-sel mengalami kelaparan dan berpengaruh pada pembentukan biofilm, yaitu sel-sel yang terimobilisasi pada permukaan padat dan secara berkala terperangkap pada matriks yang merupakan polimer organik dari mikrob tersebut. Di samping itu, penurunan jumlah nutrien menyebabkan sel-sel mikrob mengalami kematian atau terjadi pelepasan sel mikrob yang menempel menuju ke fase cair. Walaupun 57 57 demikian, semua isolat mikrob pada penelitian ini memperlihatkan kemampuan adhesi atau menempel, yang ditunjukkan oleh adanya sebagian dari koloni isolat mikrob yang mampu menempel pada lempeng stainless steel yang diidentikkan dengan substrat padat usus. Belum ditemukan laporan tentang kisaran jumlah populasi koloni mikrob yang menempel pada substrat padat yang dikatakan ideal. Akan tetapi kisaran jumlah populasi mikrob yang menempel pada penelitian berada pada kisaran yang sama dengan hasil penelitian Wirawati 2002 yang menguji penempelan pada lempeng stainless steel isolat bakteri asam laktat yng diisolasi dari tempoyak, serta Evanikastri 2003 isolat bakteri asam laktat dari sampel klinis Dilaporkan bahwa jumlah populasi mikrob yang menempel dibandingkan dengan populasi mikrob yang planktonik adalah sebanding dengan sifat hidrofobisitas, yaitu berada pada kriteria moderat atau sedang. Berdasarkan hasil analisis secara deskriptif, yaitu membandingkan data beberapa parameter yang diamati pada percobaan seleksi isolat Tabel 6 dengan literatur pendukung seperti yang telah diuraikan pada pembahasan, isolat mikrob yang dipilih sebagai kandidat probiotik dan digunakan sebagai materi pada percobaan tahap berikutnya adalah isolat A4-a Carnobacterium sp. pada mikrob amilolitik, isolat P1-an Vibrio alginoliticus pada mikrob proteolitik, dan isolat L1-a Planococcus sp. pada mikrob lipolitik. Pertimbangan memilih isolat mikrob A4-a Carnobacterium sp. pada mikrob amilolitik adalah 1 mikrob tersebut adalah fakultatif; 2 populasi mikrob ini tidak kurang dari 1 x 10 7 cfumL, dan populasi isolat pada waktu puncak 2,0 x 10 12 cfumL dengan waktu generasi 45,44 menit; 3 kemampuan hidrolisis dan degradasi substrat, serta aktivitas enzim relatif tinggi; 4 mampu bertahan hidup pada pH rendah dan pH tinggi sebagai indikator kemampuannya bertahan terhadap asam lambung dan garam empedu; 5 mempunyai aktivitas antagonistik terhadap semua mikrob patogen bagi ikan yang diuji yaitu Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, dan Vibrio harveyi; dan 6 mempunyai kemampuan adhesi atau menempel pada substrat padat. Pertimbangan memilih isolat mikrob P1an Vibrio alginoliticus pada mikrob proteolitik adalah 1 mikrob tersebut adalah fakultatif; 2 populasi mikrob tidak kurang dari 1 x 10 7 cfu mL, dan populasi isolat pada waktu puncak 6,7 x 58 58 10 10 cfu mL dengan waktu generasi 36,35 menit.; 3 kemampuan hidrolisis dan degradasi substrat, serta aktivitas enzim relatif tinggi: 4 mampu bertahan hidup pada pH rendah dan pH tinggi sebagai indikator kemampuannya bertahan terhadap asam lambung dan garam empedu; 5 mempunyai aktivitas antagonistik terhadap dua jenis mikrob patogen bagi ikan yang diuji yaitu Escherichia coli dan Vibrio harveyi; dan 6 mempunyai kemampuan adhesi atau menempel pada substrat padat. Pertimbangan memilih isolat mikrob L1a Planococcus sp. pada mikrob lipolitik adalah 1 mikrob fakultatif; 2 populasi mikrob tidak kurang dari 1 x 10 7 cfu mL, dan populasi isolat pada waktu puncak 4,4 x 10 11 cfu mL dengan waktu generasi 34,56 menit; 3 kemampuan hidrolisis dan degradasi substrat, serta aktivitas enzim lebih tinggi dibandingkan dengan isolat mikrob lipolitik lainnya; 4 mampu bertahan hidup pada pH rendah dan pH tinggi sebagai indikator kemampuannya bertahan terhadap asam lambung dan garam empedu; dan 5 mempunyai kemampuan adhesi atau menempel pada substrat padat. Simpulan Mikroflora yang berhasil diisolasi dari saluran pencernaan ikan bandeng ada 18 jenis isolat mikrob yang terdiri atas 4 jenis mikrob amilolitik aerob Moraxella sp., Aeromonas hydrophila, Citrobacter sp. dan Carnobacterium sp., 3 jenis mikrob amilolitik anaerob Staphylococcus sp. Flavobacterium sp. dan Vibrio sp., 5 jenis mikrob proteolitik aerob Streptococcus sp., Bacillus sp., Micrococcus sp., Pseudomonas sp. dan Proteus sp., 2 jenis mikrob proteolitik anaerob Vibrio alginoliticus dan jenis tidak teridentifikasi, 2 jenis mikrob lipolitik aerob Planococcus sp. dan Plesiomonas sp. dan 2 jenis mikrob lipolitik anaerob Kurthia sp. dan Serratia sp.. Mikroflora saluran pencernaan ikan bandeng yang dipilih sebagai kandidat probiotik, dan digunakan sebagai materi pada percobaan tahap berikutnya adalah isolat A4-a Carnobacterium sp. pada mikrob amilolitik, isolat P1-an Vibrio alginoliticus pada mikrob proteolitik; dan isolat L1-a Planococcus sp. pada mikrob lipolitik. 59 59 HIDROLISIS PAKAN BUATAN PREDIGESTION OLEH CRUDE ENZYME PENCERNAAN EKSOGEN YANG DISEKRESIKAN MIKROB Carnobacterium sp. Vibrio alginoliticus DAN Planococcus sp. UNTUK MENINGKATKAN PERTUMBUHAN DAN KELANGSUNGAN HIDUP LARVA IKAN BANDENG Pendahuluan Intensifikasi budi daya ikan bandeng harus diimbangi dengan penyediaan benih yang cukup dan berkesinambungan. Kebutuhan benih ikan bandeng nener pada tahun 2005 mencapai 1.387.040.000 ekor, dan diperkirakan setiap tahun kebutuhan nener akan terus meningkat Ditjen Perikanan Budi Daya 2006. Pada tahun 2009, kebutuhan nener diproyeksikan mencapai 2.172.480.000 ekor. Hasil tangkapan di alam hanya dapat memenuhi setengah dari kebutuhan nener tersebut. Alternatif yang dapat dikembangkan untuk memenuhi kebutuhan nener adalah usaha pembenihan. Akan tetapi kelangsungan usaha ini dibatasi oleh penyediaan pakan alami yang dari segi kuantitas sulit dipenuhi. Penggunaan pakan alami yang berkepanjangan, selain tidak praktis juga tidak ekonomis, dan dari segi kualitas nilai nutrien pakan alami tidak selalu konsisten atau layak. Biaya pengadaan pakan alami dapat mencapai lebih dari 35 dari total biaya produksi Djunaidah dan Komaruddin 1997. Karena beberapa alasan, suplai pakan alami kemungkinan dapat berhenti, salah satunya adalah cuaca. Kultur pakan alami secara massal sangat bergantung pada cuaca Kurokawa et al. 1998. Pada usaha pembenihan skala besar, waktu penggunaan pakan alami perlu dibatasi dan perannya digantikan oleh pakan buatan yang komposisi gizinya disesuaikan dengan kebutuhan larva ikan bandeng. Studi penggunaan pakan buatan pada pemeliharaan larva ikan bandeng menunjukkan pertumbuhan dan tingkat kelangsungan hidup larva tidak sebaik yang diberi pakan alami seperti dilaporkan oleh beberapa peneliti Duray dan Bagarinao 1984; Aslianti dan Azwar 1992; dan Aslianti et al. 1993. Pertumbuhan dan kelangsungan hidup yang cukup rendah pada larva yang diberi pakan buatan diakibatkan oleh belum lengkapnya perkembangan organ 60 60 pencernaan pada stadia awal pertumbuhan sehingga berpengaruh pada ketersediaan enzim pencernaan Lauff dan Hofer 1984; Haryati 2002. Oleh karena itu, perlu dilakukan optimasi penggunaan pakan buatan, salah satunya adalah dengan menghidrolisis predigestion pakan buatan dengan menggunakan enzim pencernaan eksogen sebelum diberikan ke larva. Pendekatan penggunaan enzim pencernaan eksogen predigestion dalam pakan buatan yang sesuai dengan kebutuhan larva ikan bandeng diharapkan dapat meningkatkan kecernaan pakan sehingga pertumbuhan dan tingkat kelangsungan hidup larva ikan bandeng dapat ditingkatkan. Pada percobaan pertama terseleksi 3 isolat mikrob yang akan diuji lebih lanjut sebagai kandidat probiotik. Isolat mikrob tersebut adalah Carnobacterium sp. pada mikrob amilolitik, Vibrio alginoliticus pada mikrob proteolitik, dan Planococcus sp. pada mikrob lipolitik. Penelitian ini dilaksanakan dalam 2 tahapan percobaan, yaitu pengujian secara in vitro dan in vivo. Percobaan I in vitro bertujuan mengkaji efektivitas crude enzyme yang disekresikan Carnobacterium sp., Vibrio alginoliticus, dan Planococcus sp. dalam menghidrolisis predigestion pakan buatan untuk larva ikan bandeng. Percobaan II in vivo bertujuan mengkaji efektivitas pakan buatan yang telah dihidrolisis predigestion dengan crude enzyme yang disekresikan Carnobacterium sp., Vibrio alginoliticus, dan Planococcus sp. dalam perbaikan pertumbuhan dan tingkat kelangsungan hidup larva ikan bandeng. Bahan dan Metode Tempat dan Waktu Percobaan I in vitro dilakukan di Laboratorium Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, serta Laboratorium Biokimia dan Mikrobiologi Nutrisi, Fakultas Peternakan, IPB. Analisis proksimat dilakukan di Laboratorium Pengujian Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian, Cimanggu, Bogor. Penelitian dilaksanakan selama 5 bulan mulai bulan Oktober 2004 sampai Februari 2005. Percobaan II in vivo dilakukan di PT. Esaputlii Prakasa Utama , Kabupaten Barru, Sulawesi Selatan. Analisis beberapa peubah dilakukan di Laboratorium 61 61 Kualitas Air, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, UNHAS, serta di Laboratorium Fisiologi dan Farmakologi, serta Laboratorium Anatomi , Fakultas Kedokteran Hewan, IPB. Penelitian dilaksanakan selama 6 bulan mulai bulan April 2005 sampai September 2005. Prosedur Penelitian Percobaan I In Vitro Percobaan pertama bertujuan menemukan konsentrasi crude enzyme dan periode inkubasi yang paling efektif menghidrolisis predigestion pakan buatan untuk larva ikan bandeng. Percobaan ini didesain menggunakan pola faktorial 5 x 6 dalam rancangan acak lengkap RAL masing-masing 3 ulangan. Faktor pertama adalah konsentrasi crude enzyme dengan 5 level, yaitu 5, 10, 15, 20, dan 2 5 mLkg pakan. Faktor kedua adalah periode inkubasi dengan 6 level, yaitu 2, 4, 6, 8, 10, dan 12 jam. Pakan yang digunakan pada percobaan ini adalah pakan berbentuk pasta yang diformulasi sesuai dengan kebutuhan nutrisi larva ikan bandeng. Komposisi pakan, hasil analisis proksimat bahan baku pakan dan pakan disajikan pada Tabel 7 dan prosedur analisis proksimat mengikuti metode Takeuchi 1988 yang disajikan pada Lampiran 14. Produksi crude enzyme mengacu pada metode yang dilakukan Irawadi 1991, dengan modifikasi pada suhu yang digunakan. Sebanyak 0,1 mL mikrob Carnobacterium sp., Vibrio alginoliticus, dan Planococcus sp. diinokulasikan dalam setiap 10 mL media masing-masing, kemudian diinkubasi selama waktu optimum pada suhu 29 o C. Waktu optimum pada Carnobacterium sp., Vibrio alginoliticus, dan Planococcus sp. secara berturut-turut adalah 14, 16, dan 18 jam. Setelah waktu optimum dicapai, kultur disentrifi us dengan kecepatan 11.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4 o C. Supernatan yang diperoleh adalah filtrat ekstrak enzim kasar crude enzyme. Crude enzyme amilase, protease, dan lipase yang dihasilkan dicampur dengan perbandingan 1 : 6 : 1. 62 62 Tabel 7. Komposisi pakan buatan untuk larva ikan bandeng, serta hasil analisis proksimat pakan dan bahan baku pakan Bahan pakan Komposisi Hasil analisis proksimat bk P BETN L SK Abu Air Tepung ikan 70,00 82,40 0,50 3,90 1,50 2,20 9,50 Tepung kedelai 5,30 36,40 24,70 20,40 3,40 1,60 12,50 Tepung terigu 5,00 8,50 77,80 1,40 2,00 1,00 6,70 Lemak 5,70 Vitamin mix 4,00 Mineral mix 10,00 Komposisi proksimat pakan bk Kadar protein 60,13 Kadar karbohidrat BETN 5,63 Kadar lemak total 9,84 Kadar serat kasar 1,36 DE kkalkg 3042,34 CP kkalg protein 5,06 Keterangan : Perbandingan lemak : minyak ikan dan minyak jagung 2 : 1 Komposisi vitamin mix Vitamin A 3500 IUkg pakan; Vitamin D 3 3000 IUkg pakan; Vitamin E 100 IUkg pakan; Vitamin K 10 mgkg pakan; Vitamin B 12 0,02; Asam askorbat 300 mgkg pakan; Biotin 0,4 mgkg pakan; Kolin 3000 mgkg pakan; Asam folat mgkg pakan; Inositol 400 mgkg pakan; Niasin 150 mgkg pakan; Asam pantotenat 60 mgkg pakan; Piridoksin 10 mgkg pakan; Riboflavin 20 mgkg pakan; Thiamin 10 mgkg pakan Komposisi mineral mix Kalsium 0,2 gkg pakan; Fosfor anorganik 7 gkg pakan; Magnesium 0,6 gkg pakan; Cu 3 mgkg pakan; Mangan 12 mgkg pakan; Selenium 0,2 mgkg pakan; Zn 20 mgkg pakan; Iodine 0,8 mgkg pakan; Fe 0,8 mgkg pakan Hasil perhitungan berdasarkan persamaan energi NRC 1988 : 1 g karbohidrat = 2,5 kkal DE 1 g protein = 3,5 kkal DE 1 g lemak = 8,1 kkal DE Komposisi pakan menurut Lee dan Liao 1976 Campuran crude enzyme dibuat sesuai dengan konsentrasi perlakuan, yang ditambahkan dalam 10 g pakan yang berfungsi sebagai substrat. Volume crude enzyme pada semua perlakuan disamakan dengan volume konsentrasi crude enzyme tertinggi dengan menambahkan aquadest. Campuran paka n dan crude enzyme kemudian diinkubasi sesuai dengan periode perlakuan. Reaksi crude enzyme dihentikan dengan cara membagi pakan menjadi 3 bagian. Satu bagian diambil sebanyak 2 g dan ditambahkan 3 mL pereaksi DNS Dinitrosalicylic acid. Campuran ini kemudian dipanaskan dalam air mendidih 63 63 selama 5 menit untuk menghentikan reaksi crude enzyme amilase Irawadi 1991. Bagian kedua diambil 0,5 g dan ditambah 1,5 mL trikhloroasetat 5, kemudian dibiarkan pada suhu ruang untuk menghentikan reaksi crude enzyme protease Bergmeyer dan Grassi 1983. Bagian yang terakhir diambil 2 g dan ditambahkan 3 mL etil alkohol 95 untuk menghentikan crude enzyme lipase Tietz dan Friedreck 1966 dalam Borlongan 1990. Parameter yang diamati adalah 1 kadar glukosa dan derajat hidrolisis karbohidrat pakan, 2 kadar protein terlarut dan derajat hidrolisis protein pakan, dan 3 derajat hidrolisis lemak pakan.

1. Kadar Glukosa dan Derajat Hidrolisis Karbohidrat Pakan