169
169 ∼
Larutan blanko yaitu 10 mL akuades ditambah dengan 1,0 mL larutan logols iodine.
∼ Sampel 0 jam sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan
diencerkan denga n akuades sampai 10 mL dan ditambah dengan 1,0 mL larutan logols iodine, kemudian dibandingkan dengan larutan standar 2,0 mL
kalau warnanya sudah hampir sama, pengenceran sudah cukup tetapi kalau masih pekat harus diencerkan sampai warnanya hampir sama.
∼ Ekstrak enzim kasar sampel 24 jam diambil sebanyak 0,5 mL dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambah akuades hingga 10 mL dan 1,0 mL larutan logols iodine.
∼ Absorbansi semua larutan diukur pada panjang gelombang 578 nm.
∼ Kemampuan mikrob mendegradasi pati dapat diketahui dengan memasukkan
nilai absorbansi dalam persamaan regresi dan mempersiapkan sebuah grafik konsentrasi pati vs absorbansi, konsentrasi yang tidak diketahui dibaca di luar
kurva ppm.
∼ Persamaan regresi Y = a + bx
d. Prosedur uji degradasi lemak
∼ Pengujian degradasi lemak oleh mikrob dilakukan dengan metode
penyabunan. ∼
Isolat mikrob ditumbuhkan dalam media yang mengandung minyak sebagai substrat sebanyak 2 gram dan dinkubasi selama 24 jam pada suhu 24
o
C. ∼
Setelah 24 jam, ditambahkan 25 mL KOH-alkohol 0,1 N kemudian direfluks selama 30 menit dengan pendinginan tegak.
∼ Setelah didinginkan, dititar dengan HCl 0,2 N dan digunakan indikator pp
sampai didapat titik akhir dengan warna merah muda. ∼
Lakukan juga terhadap blanko dan sampel 0 jam. ∼
Bilangan penyabunan mg KOHmL minyak dihitung dengan rumus : b – a mL x 56,1 x N titran
g contoh ∼
Bilangan penyabunan di konversi ke mmol lemak dengan rumus : Bilangan penyabunan sampel
x 3 Bm KOH 56,1
∼ Analisis dilakukan juga terhadap sampel 0 jam.
∼ Selisih nilai antara sampel 24 jam dan sampel 0 jam adalah volume minyak
yang telah didegradasi oleh mikrob.
170
170 Lampiran 4. Prosedur analisis aktivitas enzim
a. Prosedur analisis aktivitas enzim amilase Bergmeyer dan Grassi 1983
Perlakuan Blanko mL Standar mL Sampel mL
- Soluble starch dalam buffer sitrat pH 5,7
- Maltosa standar - Ekstrak enzim
- Akuades 1,0
- 1,0
- 1,0
1,0 -
- 1,0
- 1,0
- Dikocok dan dinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 32
o
C selama 30 menit.
DNS 3,0
3,0 3,0
Panaskan pada suhu 100
o
C selama 10 menit. Diencerkan dengan akuades sampai volume tertentu atau tergantung
kepekatan warna. Didiamkan selama beberapa menit pada suhu ruang, kemudian ukur
absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm.
b. Analisis aktivitas protease Bergmeyer dan Grassi 1983
Perlakuan Blanko mL Standar mL Sampel mL
- Buffer borat 0,01 M, pH 8,0 - Substrat kasein 20 mgmL pH 8,0
- HCl 0,05 mgmL - Enzim dalam CaCl
2
10 mmolL - Tirosin standar 5 mmolL
- Akuades 1,0
1,0 0,2
- -
0,2 1,0
1,0 0,2
- 0,2
- 1,0
1,0 0,2
0,2
- -
Dinkubasi dalam shaker water bath pada suhu 37
o
C selama 10 menit. - TCA 0,1 M
- Akuades - Enzim dalam CaCl
2
10 mmolL 3,0
- 0,2
3,0 -
0,2 3,0
0,2 -
Diamkan pada suhu 37
o
C selama 10 menit, selanjutnya sentrifius dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit
- Filtrat - Na
2
CO
3
0,4 M - Folin ciocalteau.
1,5 5,0
1,0 1,5
5,0 1,0
1,5 5,0
1,0
Diamkan pada suhu 37
o
C selama 20 menit, kemudian baca absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm
171
171
Aktivitas enzim dihitung dengan rumus :
OD Sample - OD Blanko IUmL = x faktor pengenceran x T
-1
OD Standar - OD Blanko Dimana : U
= aktivitas enzim dalam International Unit per menit OD
= absorbansi T
= waktu menit
c. Analisis aktivitas lipase Tietz dan Friedreck dalam Borlongan, 1990
