Setelah itu 10 mL FBS diambil dan dituangkan kedalam botol duran lalu ditambahkan 1 mL campuran antibiotik-antifungal penisilin-streptomisin.
Kemudian, media RPMI ditambahkan sampai 100 mL sekitar leher botol. Diberi penandaan pada botol dengan nama media dan tanggal pembuatan
media kultur.
6. Uji sitotoksisitas ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel
kanker kolon WiDr dengan metode MTT a.
Kultur sel WiDr
Sel WiDr diambil dari tangki nitrogen dan segera dicairkan dalam penangas air 37
°
C. Ampul disemprot dengan etanol 70 dan dimasukkan dalam LAF. Ampul dibuka dan sel WiDr dipindahkan ke dalam conical tube
steril yang telah berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 650 rpm selama 3 menit dan supernatan
yang terbentuk dibuang. Medium RPMI 1640 yang baru ditambahkan kedalam suspensi sel dan disentrifugasi kembali selama 5 menit hingga
homogen dan dicuci ulang sekali lagi. Setelah suspensi sel WiDr didapatkan, ditambahkan 1 mL media kultur yang mengandung 10 FBS. Resuspensikan
kembali secara perlahan hingga homogen. Sel WiDr kemudian ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37
°
C. Setelah 24 jam, medium kultur WiDr diganti dan sel WiDr ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.
b. Panen Sel WiDr
Setelah sel WiDr konfluen, medium kultur dibuang kemudian sel WiDr dicuci dengan 3,5 mL PBS sebanyak 2 kali. Tripsin-EDTA sebanyak
300 L ditambahkan dalam sel WiDr dan dilakukan inkubasi selama 3 menit
dalam inkubator CO
2
. Sebanyak ± 5 mL media kultur ditambahkan kembali dan sel WiDr diresuspensikan hingga terlepas seluruhnya dari dinding flask.
Suspensi sel dipindahkan ke dalam conical tube steril baru. Sel WiDr dihitung dengan haemocytometer dan cell counter dan dibuat konsentrasi
suspensi sel yang digunakan untuk penelitian yaitu sebesar 2x10
4
100 µL. c.
Preparasi larutan uji ekstrak daun keladi tikus
Ekstrak daun keladi tikus ditimbang ± 1 mg dan dimasukkan dalam tabung effendorf kemudian dilarutkan dalam 1 mL DMSO dan divortex
sampai homogen untuk mendapatkan larutan ekstrak induk dengan konsentrasi 1 mgmL. Larutan induk diencerkan dengan media kultur hingga
diperoleh seri konsentrasi 1; 10; 100; 400; 1000; 1200; dan 1500 gmL.
d. Preparasi larutan kontrol positif doksorubisin
Doksorubisin dengan konsentrasi stok 2000 M dibuat seri
konsentrasi 1; 10; 25; 50; 100; dan 250
M dalam media kultur. e.
Uji sitotoksik dengan MTT assay
Orientasi dilakukan untuk menentukan rentang konsentrasi yang akan dilakukan dalam uji. Sebanyak 100 µL ekstrak daun keladi
tikus dengan kadar 1; 10; 100; 400; 1000; 1200; dan 1500 gmL
diteteskan pada suspensi sel WiDr dengan kepadatan 2x10
4
100 L
dalam sumuran yang berbeda pada well plate. Sebagai kontrol, tiga buah
