Uji Apoptosis Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi Tikus dengan Metode

oleh etidium bromida lebih dominan daripada yang ditimbulkan akridin oranye, sehingga pada sel yang mengalami nekrosis berwarna merah sedangkan sel yang mengalami apoptosis berwarna oranye kemerahan. Sel yang masih hidup berwarna hijau merata, sedangkan sel yang mengalami apoptosis memiliki warna oranye terfragmentasi yang menandakan bahwa sel mengalami fase late apoptosis atau berwarna hijau seperti sel hidup namun terdapat warna kekuningan di bagian tengah sel yang berarti terdapat kondensasi kromatin yang menandakan sel mengalami fase early apoptosis. Sel yang berwarna merah merata adalah sel yang mengalami nekrosis Gambar 8. A B C Gambar 8. Hasil Uji Double Staining Ekstrak Keladi Tikus. Kontrol sel A, Perlakuan dengan ekstrak keladi tikus 102 µgmL B, Perlakuan dengan Doksorubisin 21 µgmL C Apoptosis Nekrosis Sel Hidup Konsentrasi yang digunakan dalam uji ini adalah sesuai dengan nilai IC 50 yang didapatkan pada uji MTT yaitu 102 µgmL untuk ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan 21 µM untuk doksorubisin. Uji double staining merupakan uji kualitatif, namun dapat dijadikan sebuah uji semi-kuantitatif, dengan pengambilan beberapa layang pandang yaitu tiga buah foto gambaran keadaan sel tiap satu preparat, yang dianggap mewakili seluruh keadaan sel dalam preparat tersebut. Pembacaan hasil dilakukan dengan bantuan blind reader. Sebanyak tiga orang pengamat diminta untuk menghitung jumlah sel yang mengalami apoptosis, nekrosis dan sel yang masih hidup pada foto sel, tanpa mengetahui perlakuan yang diberikan terhadap sel yang diamati. Tabel I menunjukan bahwa sebanyak 65.275±1.27 sel mengalami apoptosis. Hal ini menunjukan bahwa ekstrak etil asetat daun keladi tikus pada IC 50 102 gmL menginduksi terjadinya apoptosis, meskipun tidak sebesar Doksorubisin yaitu sebesar 92.916±2.204 Menurut Mohan, et al. 2010 ekstrak keladi tikus menginduksi apoptosis sel melalui peningkatan sitokrom c, suatu protein heme yang berperan sebagai pembawa elektron yang larut dalam air dalam fosforilasi oksidatif mitokondria. Sitokrom c dapat berinteraksi dengan Apaf-1 membentuk CARD Caspase Recruitment Domain . Beberapa CARD kemudian bergabung membentuk kompleks apoptosome kemudian mengikat pro-caspase 9 dan mengaktivasinya menjadi caspase 9 inisiator kaspase. Caspase 9 mengaktivasi procaspase-3 menjadi caspase 3. Caspase 3 membelah gelsolin, suatu protein yang berfungsi untuk memelihara morfologi sel. Jika gelsolin dibelah, timbul pembelahan filament aktin didalam sel sehingga sel kehilangan integritasnya. Caspase 3 juga memotong Poly ADP Adenosine Diphosphate-Ribose Polymerase PARP, sebuah enzim yang berperan dalam perbaikan dan pemeliharaan DNA. Caspase 3 merupakan caspase efektor yang menimbulkan apoptosis pada sel. Tabel I. Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode double staining Sel Apoptosis ±SD Nekrosis ±SD Hidup ± SD Ekstrak Keladi Tikus 65.27±1.27 14.16±0.48 20.94±1.42 Doksorubisin 92.91±2.20 2.975±2.59 5.41±0.0005 Kontrol Sel 1.081 98.9

D. Uji Imunositokimia COX-2 akibat perlakuan ekstrak

Uji imunositokimia merupakan uji yang dilakukan untuk mendeteksi keberadaan suatu protein didalam sel. Tujuan dilakukan uji imunositokimia dalam penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kemampuan ekstrak dalam menghambat ekspresi siklooksigenase-2 COX-2, suatu protein yang banyak diekspresikan oleh sel kanker WiDr Palozza et al, 2004 dan memiliki aktivitas memicu proliferasi sel Breyer, Bagdassarian, Myers, and Breyer, 2001. Peningkatan COX-2 didalam sel kanker kolon WiDr dapat menurunkan kemampuan apoptosis sel dan melindungi sel dari apoptosis yang di induksi oleh berbagai sinyal. Oleh sebab itu, hal ini dapat meningkatkan potensi tumorigenik sel Richter, Weiss, Weinberger, Furstenberger, and Marian, 2001. COX-2 dapat memicu proliferasi sel dengan meningkatkan produksi PGE-2 yang dapat menghambat terjadinya apoptosis dengan meningkatkan protein anti apoptosis yaitu BCl -2 Sheng, Shao, Morrow, Beauchamp, and DuBois,1998 serta mengikat protein pro apoptosis BAX. Pemberian inhibitor COX-2 pada jaringan atau sel karsinoma dan adenoma dapat menurunkan populasi sel, menghambat ekspresi COX-2, dan BCl -2 Richter et al, 2001. Pengobatan dengan inhibitor COX-2 seperti NSAID tidak disarankan karena dapat berbahaya bagi ginjal dan saluran pencernaan bila digunakan dalam waktu yang lama. Sel yang tidak mengekspresikan COX-2 berwarna keunguan, sedangkan yang mengekpresikan COX-2 berwarna coklat pekat, hal ini dikarenakan adanya staining secara enzimatis oleh peroksidase pada uji imunositokimia Gambar 9. Skoring secara semi kuantitatif dilakukan dalam pengujian imunositokimia untuk menentukan hasil positif atau negatif ada tidaknya suatu protein. Skoring dilakukan dengan cara menghitung persentase sel yang mengekspresikan COX-2 dalam suatu preparat. Hasil negatif didapatkan apabila sel yang mengekspresikan COX- 2 ≤5 dan positif apabila sel yang mengekspresikan COX-2 5. Vang, Gown, Barry, Wheeler, and Ronnet, 2006. Skor COX-2 dalam penelitian ini adalah 3+ 51 -75 sel mengekpresikan COX-2 untuk kontrol sel, dan 2+ 26 - 50 sel mengekspresikan COX-2 untuk perlakuan dengan ekstrak keladi tikus dan doksorubisin. Pembacaan hasil penelitian dilakukan dengan melibatkan 3 tiga orang blind reader untuk menghitung jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 dalam suatu preparat tanpa mengetahui perlakuan yang diberikan terhadap sel yang diamati. Hasil yang diperoleh menunjukan bahwa ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan doksorubisin memiliki kemampuan dalam menghambat ekspresi protein COX-2, dan keduanya memiliki potensi yang berbeda tidak bermakna secara statistik dengan uji t α = 0.05. Tabel II menunjukan jumlah rata-rata sel yang mengekspresikan COX-2 mengalami penurunan pada perlakuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus dan pada perlakuan kontrol positif doksorubisin bila