Apoptosis dan Nekrosis TINJAUAN PUSTAKA

Faktor internal antara lain adalah supresor tumor p53 dan antimetabolit penghambat nutrien Subowo, 2011. Apoptosis dapat dihambat oleh sinyal dari sel lain atau lingkungan sekitarnya melalui jalur yang disebut survival factors. Hal ini melibatkan faktor pertumbuhan, hormon seperti estrogen dan androgen, asam amino netral, zink, dan interaksi dengan matrik protein ekstraseluler. Beberapa sel dan protein virus dapat beraksi sebagai inhibitor kaspase. Regulator terpenting dalam apoptosis adalah sinyal internal dari protein BCl -2. Anggota dari keluarga protein ini memiliki aktivitas antiapoptosis dan proapoptosis yang menentukan kehidupan dan kematian sebuah sel. Protein-protein ini berinteraksi satu sama lain untuk menekan atau mempropagasi aktivitasnya sendiri dengan melakukan berbagai aksi langkah apoptosis. Mereka juga dapat berinteraksi secara independen terhadap mitokondria untuk mengeluarkan sitokrom c, yang merupakan agen apoptosis yang paling poten Ross and Pawlina, 2006. Nekrosis pada umumnya dianggap sebagai kematian sel yang tidak terkontrol dan biasanya terjadi karena kecelakaan. Secara biokimiawi, penyebab yang paling dominan adalah adanya deplesi energi, pembentukan spesies oksigen reaktif dan aktivasi protease non-apoptosis. Hal-hal tersebut menyebabkan hilangnya fungsi homeostatis pada pompa ion dan kerusakan pada membrane lipid serta pembengkakan membran sel dan selanjutnya sel mengalami ruptur Osthoff, 2008. Nekrosis merupakan proses kematian sel secara patologik yang dapat menimbulkan peradangan. Nekrosis dapat disebabkan oleh mikroorganisme, virus, bahan kimia dan agen-agen lain yang dapat merusak jaringan hipotermia, hipoksia, radiasi, pH rendah, dan trauma. Terjadi influx air dan ion-ion dari celah ekstraselular, sebagai akibat kerusakan membran sel. Kejadian ini berlanjut dengan pelepasan kandungan sitoplasma, termasuk enzim-enzim dalam lisosom ke dalam celah ekstraselular Subowo, 2011. Dalam kondisi fisiologis, kerusakan membran plasma dapat juga disebabkan oleh virus, substansi seperti komplemen, atau protein yang disebut perforin. Pembengkakan sel yang cepat dan lisis adalah dua karakteristik dalam proses ini Ross, 2006. G. Uji sitotoksik dengan metode MTT Uji MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 difenil tertazolium bromide didasarkan pada konversi MTT menjadi kristal formazan oleh sel hidup, yang menggambarkan aktivitas mitokondrial. Karena pada umumnya aktivitas mitokondrial total dalam suatu populasi sel berhubungan dengan jumlah sel yang hidup, uji ini dipakai secara luas untuk mengukur efek sitotoksik obat secara in vitro terhadap suatu sel Meerlo, Kaspers, and Closs, 2011. Uji MTT dilakukan untuk melihat kemampuan sel hidup untuk mengonversi garam tetrazolium yang larut dalam air. [3 –4,5-dimethylthiazol-2- yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide] MTT diubah menjadi formazan yang tidak larut dalam air Gambar 4. Garam tetrazolium menerima elektron dari substrat yang teroksidasi atau enzim yang sesuai, seperti NADH dan NADPH. MTT tereduksi pada bagian ubikuinon, sitoktom b dan c pada bagian transpor elektron mitokondria dan merupakan hasil dari aktivitas enzim suksinat dehidrogenase Supino, 1995. Uji sitotoksik selain uji MTT adalah lactate dehydrogenase LDH assay. Uji ini memiliki didasarkan atas deteksi kebocoran lactate dehydrogenase pada sel yang mati. Uji yang lain adalah neutral red NR dengan prinsip pewarnaan lisosom pada sel hidup, serta uji kandungan protein protein assay pada sel hidup. Diantara keempat uji sitotoksik tersebut, MTT memiliki sensitivitas yang paling baik Fotakis and Timbrell, 2006. Keuntungan penggunaan uji MTT adalah kemampuannya untuk mengukur dalam waktu yang relatif pendek, bahkan dalam doubling period suatu sel, dan perbedaan dalam aktivitas metaboliknya Sieuwerts, Klijin, Peters, and Foekens, 1995. MTT adalah garam larut dalam air, bermuatan positif bersifat permeabel terhadap membran sel Riss et al., 2013 yang dapat diubah menjadi formazan berwarna ungu yang tidak dapat larut dengan pemotongan cincin tetrazolium dengan enzim suksinat dehidrogenase didalam mitokondria. Produk formazan tersebut bersifat impermeabel terhadap membran sel dan juga terakumulasi dalam sel sehat. Uji MTT telah diuji validitasnya dalam banyak lini galur sel Mossmann, 1983. Beberapa bukti terakhir menyimpulkan bahwa reduksi MTT juga dapat diperantarai oleh NADH atau NADPH didalam sel dan diluar mitokondria Berridge and Tan, 1992. Gambar 5. Reaksi MTT menjadi Formazan

H. Uji apoptosis double staining

Sejak awal kemunculannya, metode uji flow cytometric propidum iodide PI telah digunakan secara luas sebagai uji apoptosis pada banyak model eksperimental. Metode ini didasarkan pada karakteristik sel yang mengalami apoptosis yaitu adanya fragmentasi DNA dan hilangnya DNA pada inti sel. Metode ini menggunakan agen fluorochrome, contohnya PI, yang dapat berikatan dan melabeli DNA. Metode ini mampu mendapatkan hasil uji DNA sel yang cepat selesai dalam 2 jam. Sejak publikasinya uji PI telah digunakan secara luas pada banyak laboratorium Riccardi and Niccoleti, 2006. Agen fluorochrome yang lain adalah Acridine orange AO, yang dapat berikatan dengan semua asam nukleat dan dapat menembus membran, bersama dengan propidium iodide PI yang merupakan pewarna yang tidak dapat menembus membran yang juga mengikat semua asam nukleat merupakan kombinasi pewarna untuk mengetahui integritas sel. PI berflouresensi merah apabila berikatan dengan asam nukleat dan AO berflouresensi hijau apabila berikatan dengan DNA untai ganda dan berflouresensi merah apabila berikatan dengan RNA atau DNA untai tunggal Helberstadt and Emerich, 2007. Uji viabilitas sel double-staining dengan komponen yang dapat menyisip DNA yaitu acridine orange dan ethidium bromide AOEB atau propidium iodide PI didasarkan pada prinsip bahwa acridine orange AO dapat masuk ke dalam sel hidup ataupun sel mati, sedangkan EB dan PI hanya dapat menembus membran sel yang mengalami disintegrasi. Sel hidup berwarna hijau jika dibaca dibawah mikrokop floresens dan sel mati berwarna merah Kavanagh, 2007.

I. Uji Imunositokimia

Imunositokimia merupakan cabang dari penelitian mikroskopik dimana antibodi digunakan untuk mendeteksi keberadaan suatu molekul pada level mikroskop cahaya maupun elektron. Imunositokimia adalah perbaikan dari metode sebelumnya yaitu histokimia dan sitokimia enzim dimana molekul reaktif atau aktivitas enzim dideteksi sebagai reaksi warna Vaughn, 2013. Imunositokimia merupakan identifikasi komponen jaringan secara in situ dengan interaksi antigen-antibodi spesifik dimana antibodi tersebut telah dilabeli. Cell staining merupakan metode yang kuat untuk mendemonstrasikan keberadaan suatu molekul spesifik didalam sel. Dalam metode ini, antibodi spesifik yang berikatan dengan antigen dideteksi dengan reagen sekunder, biasanya berupa antibodi lain yang sudah dilabeli fluophore atau enzim Javois, 1999. Terdapat beberapa jenis imunositokimia, yaitu langsung direct dan tidak langsung indirect. Imunositokimia langsung menggunakan antibodi primer berlabel. Sebagai contoh, untuk mendeteksi suatu antigen didalam sel, antibody primer yang digunakan adalah adalah rabbit anti-antigen yang dilabeli dengan fluophore . Prosedur ini hanya menggunakan antibody primer dan tidak