Pengamatan ekpresi protein dengan metode imunositokimia

200 L untuk tiap sumuran. Coverslip dimasukkan kedalam 24-well plate menggunakan pinset dengan hati-hati. Dua ratus µL suspensi sel dimasukkan tepat diatas coverslip secara merata dan perlahan, kemudian didiamkan selama 3-30 menit dalam inkubator agar sel menempel pada coverslip . Sebanyak 800 µL media kultur sel WiDr ditambahkan kedalam sumuran secara perlahan. Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Inkubasi sel dilakukan di dalam inkubator selama semalam. Sebanyak satu konsentrasi sampel pada IC 50 dibuat untuk sampel perlakuan dan media kultur untuk kontrol sel, masing-masing sebanyak 1000 µL. Sebuah 24 well plate yang telah berisi sel diambil dari inkubator. Semua media kultur dari sumuran dibuang dengan mikropipet secara perlahan. Sel dicuci dengan PBS 500 L kemudian PBS dibuang. Sampel berupa ekstrak etil asetat daun keladi tikus atau doksorubisin sebanyak 1000 µL dimasukkan kedalam sumuran. Kemudian sebanyak 1000 µL media kultur sel dimasukkan kedalam sumuran sebagai kontrol sel. Kemudian diinkubasikan didalam inkubator selama 15 menit. Kondisi sel WiDr diamati sebelum difiksasi. Media kultur dibuang seluruhnya dari sumuran dan masing-masing dicuci dengan 500 µL PBS. PBS dibuang dan coverslip diambil menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati. Coverslip diletakkan di dalam 24-well plate dan diberi label pada masing-masing perlakuan. Sebanyak 300 µL methanol dingin ditambahkan dan diinkubasi selama 10 menit dalam freezer. Methanol dibuang secara perlahan dan coverslip dijaga agar tidak terbalik. Sebanyak 500 µL PBS kemudian ditambahkan pada coverslip dan didiamkan selama 5 menit. PBS kemudian diambil dengan mikropipet 1000 µL kemudian ditambahkan 500 µL akuades. Akuades dibuang setelah 5 menit dan dilakukan pencucian dengan akudest selama 2 kali. Larutan hidrogen peroksida blocking solution ditambahkan pada coverslip , lalu diinkubasikan selama 10 menit. Larutan dibuang dengan mikropipet dan diteteskan predilute blocking serum kemudian diinkubasikan selama 10 menit. Larutan dibuang dan ditetesi antibodi monoklonal primer mouse anti-human COX-2. 500 µL PBS ditambahkan kedalam sumuran dan diinkubasi selama 5 menit. PBS dibuang dan ditetesi antibodi sekunder rabbit anti-mouse COX-2 yang dilabeli oleh biotin biotinylated universal secondary antibody serta diinkubasi selama 10 menit. 500 µ L PBS ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit. PBS dibuang dan diteteskan dengan reagen yang berisi kompleks streptavidin-enzim peroksidase lalu diinkubasi selama 10 menit. Kemudian 500 µ L PBS ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit. PBS dibuang dan diteteskan larutan substrat kromogen DAB lalu diinkubasi selama 10 menit. Sebanyak 500 µ L akuades ditambahkan kemudian buang kembali. Larutan haemotoxylin diteteskan dan diinkubasi selama 3 menit. 500 µL akuades ditambahkan lalu di buang kembali. Coverslip diangkat dengan pinset secara hati-hati kemudian dicelupkan dalam larutan xylol. Coverslip kemudian dicelupkan dalam alkohol dan dikeringkan. Coverslip kemudian diletakkan di atas object glass dan ditetesi dengan mounting media. Tutup coverslip dengan coverslip kontak dan ekspresi protein diamati dengan mikroskop.

F. Tata Cara Analisis Hasil

1. Uji MTT Dari data yang diperoleh pada uji MTT, dihitung viabilitas selnya dengan menggunakan rumus : � � −� � � � � −� � � x 100 Setelah data viabilitas di plot pada tabel, IC 50 dihitung dengan menggunakan program R-2.14.0, suatu aplikasi statistika open source yang dikembangkan oleh Dr. Enade Perdana Istyastono, PhD, Apt. 2. Uji Double Staining Sel yang berwarna hijau menunjukkan sel yang hidup, sedangkan sel yang berwarna merah menunjukkan sel yang mati. Sel utuh berwarna merah menunjukkan sel nekrosis sedangkan sel yang terfragmentasi menunjukkan sel yang mengalami apoptosis karena pada sel yang mengalami apoptosis terbentuk badan-badan apoptosis. Pembacaan data dilakukan dengan bantuan blind reader. Sebanyak tiga orang responden menghitung jumlah sel yang mengalami apoptosis, nekrosis atau sel hidup pada preparat yang terdiri dari tiga bagian tiap preparatnya. Hasil yang didapatkan berupa rata-rata ± SD. 3. Uji Immunositokimia Ekspresi protein tertentu misal COX-2 ditunjukkan dengan warna coklat pada sitoplasma bukan inti sel. Pembacaan data dilakukan dengan bantuan blind reader. Sebanyak tiga orang responden menghitung jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 pada preparat yang terdiri dari tiga bagian tiap preparatnya. Hasil yang didapatkan berupa rata-rata ± SD. Skoring dilakukan dengan cara menghitung persentase sel yang mengekspresikan COX-2 dalam satu preparat. Hasil negatif didapatkan apabila sel yang mengekspresikan COX- 2 ≤5 dan positif apabila sel yang mengekspresikan COX-2 5. Nilai skor diberikan sesuai dengan persentase sel yang mengekspresikan COX-2; Skor 0 : 5; Skor 1 : 6 – 25; Skor 2 : 26 –50; Skor 3: 51–75; dan Skor 4 : 76–100. Vang, Gown, Barry, Wheeler, and Ronnet, 2006