Setelah sel WiDr konfluen, medium kultur dibuang kemudian sel WiDr dicuci dengan 3,5 mL PBS sebanyak 2 kali. Tripsin-EDTA sebanyak
300 L ditambahkan dalam sel WiDr dan dilakukan inkubasi selama 3 menit
dalam inkubator CO
2
. Sebanyak ± 5 mL media kultur ditambahkan kembali dan sel WiDr diresuspensikan hingga terlepas seluruhnya dari dinding flask.
Suspensi sel dipindahkan ke dalam conical tube steril baru. Sel WiDr dihitung dengan haemocytometer dan cell counter dan dibuat konsentrasi
suspensi sel yang digunakan untuk penelitian yaitu sebesar 2x10
4
100 µL. c.
Preparasi larutan uji ekstrak daun keladi tikus
Ekstrak daun keladi tikus ditimbang ± 1 mg dan dimasukkan dalam tabung effendorf kemudian dilarutkan dalam 1 mL DMSO dan divortex
sampai homogen untuk mendapatkan larutan ekstrak induk dengan konsentrasi 1 mgmL. Larutan induk diencerkan dengan media kultur hingga
diperoleh seri konsentrasi 1; 10; 100; 400; 1000; 1200; dan 1500 gmL.
d. Preparasi larutan kontrol positif doksorubisin
Doksorubisin dengan konsentrasi stok 2000 M dibuat seri
konsentrasi 1; 10; 25; 50; 100; dan 250
M dalam media kultur. e.
Uji sitotoksik dengan MTT assay
Orientasi dilakukan untuk menentukan rentang konsentrasi yang akan dilakukan dalam uji. Sebanyak 100 µL ekstrak daun keladi
tikus dengan kadar 1; 10; 100; 400; 1000; 1200; dan 1500 gmL
diteteskan pada suspensi sel WiDr dengan kepadatan 2x10
4
100 L
dalam sumuran yang berbeda pada well plate. Sebagai kontrol, tiga buah
well berisi 100 µ L suspensi sel ditambahkan 100 µL media kultur.
Doksorubisin sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 1; 10; 25; 50; 100; 250 ditambahkan ke dalam sumuran.
Sel yang telah diberi perlakuan kemudian diinkubasi selama semalam didalam inkubator dengan suhu 37
C, kemudian seluruh larutan uji dan media dibuang seluruhnya dan ditambahkan 100
L reagen MTT ke dalam masing-masing sumuran, diinkubasikan selama 2-4 jam. Reagen stopper ditambahkan dan kemudian sel
didiamkan selama semalam. Absorbansi setiap sumuran dibaca
menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. 7.
Uji induksi apoptosis dengan metode Double Staining a.
Penanaman sel kanker WiDr
Sel kanker WiDr diambil dari inkubator CO
2
kemudian dipanen. Sel yang digunakan adalah sel yang sudah dalam kondisi 80 konfluen.
Dilakukan perhitungan sel dan dibuat suspensi sel sebanyak 5x10
4
sel tiap 200
L untuk tiap sumuran. Coverslip dimasukkan kedalam 24-well plate menggunakan pinset dengan hati-hati. Dua ratus µL suspensi sel
dimasukkan tepat diatas coverslip secara merata dan perlahan, kemudian didiamkan selama 3-30 menit dalam inkubator agar sel menempel pada
coverslip . Sebanyak 800 µL media kultur sel WiDr ditambahkan kedalam
sumuran secara perlahan. Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Dilakukan inkubasi sel dalam inkubator selama semalam.
Sebanyak satu konsentrasi sampel pada IC
50
terhadap sel kanker kolon
WiDr dibuat untuk sampel perlakuan dan media kultur untuk kontrol sel, masing-masing sebanyak 1000 µL.
b. Perlakuan Double Staining Sampel pada Sel
Sel WiDr dalam 24-well plate diambil dari inkubator. seluruh media kultur dari tiap-tiap sumuran dibuang dengan mikropipet secara
perlahan. Kemudian, kedalam tiap sumuran diteteskan 500 L PBS untuk
mencuci sel WiDr. Kemudian PBS dibuang dari sumuran dan ditambahkan sebanyak 1000 µ L larutan uji ekstrak etil asetat daun keladi tikus atau
doksorubisin dengan konsentrasi sesuai IC
50
terhadap sel kanker kolon WiDr kedalam sumuran. Media kultur dimasukkan diatas kontrol sel dan
kemudian diinkubasikan didalam inkubator selama 24 jam. Setelah diinkubasi, semua media dari sumuran dibuang dan masing-masing dicuci
dengan 500 µL PBS. PBS kemudian dibuang dan coverslip diambil menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati.
Letakkan coverslip di atas object glass kaca obyek dan diberi label. Teteskan 10 µ L reagen campuran ethidium bromide-akridin oranye di atas
coverslip dan ratakan dengan cara digoyangkan secara perlahan. Preparat
tersebut kemudian diamati di bawah mikroskop fluoresens dan didokumentasikan.
8. Pengamatan ekpresi protein dengan metode imunositokimia
Sel kanker WiDr diambil dari inkubator CO
2
kemudian dipanen. Sel yang digunakan adalah sel yang sudah dalam kondisi 80 konfluen.
Dilakukan perhitungan sel dan dibuat suspensi sel sebanyak 5x10
4
sel tiap
200 L untuk tiap sumuran. Coverslip dimasukkan kedalam 24-well plate
menggunakan pinset dengan hati-hati. Dua ratus µL suspensi sel dimasukkan tepat diatas coverslip secara merata dan perlahan, kemudian
didiamkan selama 3-30 menit dalam inkubator agar sel menempel pada coverslip
. Sebanyak 800 µL media kultur sel WiDr ditambahkan kedalam sumuran secara perlahan. Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat
distribusi sel. Inkubasi sel dilakukan di dalam inkubator selama semalam. Sebanyak satu konsentrasi sampel pada IC
50
dibuat untuk sampel perlakuan dan media kultur untuk kontrol sel, masing-masing sebanyak
1000 µL. Sebuah 24 well plate yang telah berisi sel diambil dari inkubator.
Semua media kultur dari sumuran dibuang dengan mikropipet secara perlahan. Sel dicuci dengan PBS 500
L kemudian PBS dibuang. Sampel berupa ekstrak etil asetat daun keladi tikus atau doksorubisin sebanyak
1000 µL dimasukkan kedalam sumuran. Kemudian sebanyak 1000 µL media kultur sel dimasukkan kedalam sumuran sebagai kontrol sel.
Kemudian diinkubasikan didalam inkubator selama 15 menit. Kondisi sel WiDr diamati sebelum difiksasi. Media kultur dibuang seluruhnya dari
sumuran dan masing-masing dicuci dengan 500 µL PBS. PBS dibuang dan coverslip diambil menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum
dengan hati-hati. Coverslip diletakkan di dalam 24-well plate dan diberi label pada masing-masing perlakuan. Sebanyak 300 µL methanol dingin
ditambahkan dan diinkubasi selama 10 menit dalam freezer. Methanol
