10. Imunositokimia
a. Perhitungan sel Sel yang berada di dalam cawan petri diberi MK hingga memenuhi
permukaan cawan. MK diambil dan dimasukkan dalam conical tube. Cairan sel diambil sedikit dan dituang diatas kaca preparat untuk menghitung jumlah sel.
Kaca preparat diletakan diatas Haemositometer alat penghitung sel, kemudian diamati menggunakan mikroskop inverter perbesaran 10 kali dan dilakukan
penghitungan dengan bantuan counter. Sel sudah sesuai dengan kriteria apabila jumLahnya antara minimal 50.000- 100.000 sel, jika hasil perhitungan sel sudah
sesuai maka dilanjutkan dengan preparasi sel tersebut. Dimasukka 5 mL MK kedalam conical tube yang baru dan ditambahkan 1,25 mL sel dari conical tube
awal kedalam conical tube yang berisi 5 mL MK. b. Subkultur sel
Cover slip dimasukkan ke dalam well plate sesuai dengan jumlah sampel dan kontrol yang digunakan. Campuran MK dan sel yang ada di conical tube
dimasukkan pada 24 well-plate yang telah diisi coverslip sebanyak 1 mL. Inkubasi dilakukan selama 24 jam didalam inkubator CO
2
. c. Perlakuan
MK yang ada di dalam well plate disedot kemudian diisi dengan sampel sebanyak 1 mL. Di dalam well plate juga diberi kontrol sel, kontrol positif, dan
kontrol negatif.
d. Perlakuan imunositokimia Coverslip dipindahkan diatas kaca preparat dengan bantuan pinset dan
jarum agar tidak merusak sel dan peletakan coverslip juga harus tepat, tidak boleh terbalik. Pada ujung kaca preparat diberi label yang dilapisi dengan selotip agar
tidak lepas atau sobek saat diberi perlakuan. Kaca preparat dipindahkan pada tempat kayu untuk memudahkan memberi reagen imunositokimia. Mula–mula
dilakukan pencucian dengan PBS sebanyak dua kali dengan cara menggenangi coverslip yang ada diatas kaca preparat dengan PBS yang diambil menggunakan
micropipet asal tergenang. PBS ditarik atau disedot kembali dengan menggunakan micropipet yang berbeda, hal ini dilakukan dengan hati- hati agar
coverslip tidak terjatuh. Lalu dilakukan fiksasi metanol selama 10 menit, fiksasi metanol juga dilakukan dengan cara yang sama dengan pencucian PBS yaitu
dengan menggenangi coverslip dengan metanol dan menarik kembali setelah 10 menit. Selanjutnya, dilakukan pencucian PBS dua kali dan akuades dua kali, lalu
dibuat campuran H
2
O
2
: H
2
O = 1:9, campuran diambil sebanyak 100 µL untuk diteteskan diatas coverslip, didiamkan selama 10 menit kemudian ditarikdisedot
kembali menggunakan micropipet yang berbeda. Kemudian, preparat dicuci PBS sebanyak dua kali. Larutan bloking ditambahkan 100 µL, didiamkan 10 menit dan
kembali disedot. Antibodi primer ditambahkan sebanyak 50 µL dan didiamkan selama satu jam, antibodi primer dan diratakan dipermukaan coverslip, seluruh
coverslip diberi antibodi primer kecuali kontrol negatif. Cairan disedot kemudian dibuang. PBS ditambahkan untuk pencucian. Antibodi sekunder universal
ditambahkan sebanyak 100 µL dan didiamkan selama 20 menit, cairan disedot dan
kemudian dibuang. Streptavidin HRP ditambahkan sebanyak 100 µL, didiamkan selama 10 menit, cairan disedot kemudian dibuang. Proses pencucian PBS
dilakukan sebanyak dua kali. Sebanyak 100 µL DAB ditambahkan dan didiamkan selama 2 menit. Akuades ditambahkan untuk mencuci sebanyak dua kali, disedot
kemudian dibuang. Perwarna hematoxilin ditambahkan sebanyak 100 µL dan didiamkan selama 5 menit, kembali dicuci akuades dua kali hingga bersih dan
warna biru dari pewarna hilang. Etanol absolut ditambahkan dengan cara menggenangi preparat dan langsung ditarik kembali kemudian digenangi xylol
dan kembali langsung ditarik. Coverslip yang ada di atas preparat dikeringkan selama beberapa menit. Setelah kering, coverslip ditempel diatas object glass
dengan cara memberikan setetes etilen dan diaratakan di atas coverslip. Preparat imunositokimia dapat diamati menggunakan mikroskop cahaya.
Javois, 1999.
Kategori