start. ELISA reader dimatikan, kertas hasil pembacaan menggunakan ELISA reader di fotocopy dan ditempel pada logbook. Data yang diperoleh diolah untuk
mendapatkan nilai IC
50
dengan membuat grafik absorbansi versus konsentrasi menggunakan program Microsoft Excell serta dilanjutkan dengan program R.
Persentase sel yang hidup dihitung dengan rumus: Persentase sel hidup =
X 100 Doyle dan Griffiths, 2000.
9. Uji apoptosis Annexin V Fluos
a. Perlakuan sel
Penanaman sel T47D dilakukan pada 6 well-plate, tiap sumuran diisi dengan 2 mL. Jumlah sel sekitar lima ratus ribu hingga satu juta sel. Diinkubasi
selama 24 jam didalam inkubator CO
2
. Selanjutnya, plate sel yang telah diinkubasi diambil dan dimasukkan dalam LAF, seluruh media dalam sumuran
disedot menggunakan micropipet dan dibuang. Selanjutnya dicuci PBS sebanyak satu kali, PBS disedot kembali menggunakan micropipet. Sampel pada
konsentrasi IC
50
dimasukkan dalam well-plate sebanyak 2 mL. Kemudian diinkubasi selama 24 jam.
b. Pra Perlakuan Annexin V Fluos Well-plate yang telah diinkubasi dengan sampel diambil dan disiapkan
conical tube untuk memindahkan media yang ada pada well-plate kedalam conical tube.sesuai dengan jenis masing- masing sampel yang ada, termasuk
kontrol sel. Well-plate yang telah kosong dicuci menggunakan PBS sebanyak 1 mL. Kemudian, PBS ditarik kembali menggunakan micropipet dan dimasukkan
ke dalam conical tube yang sesuai dengan tiap sampel. Selanjutnya, dimasukkan tripsin kedalam well-plate sebanyak 200 µL, diinkubasi selama 3 menit, dan
diamati menggunakan mikroskop hingga terlihat bentuk bulat transparan yang menunjukkan sel T47D. Ditambahkan MK sebanyak 1 mL kedalam plate, lalu
disedot kembali dan ditampung pada conical tube. Dilakukan sentrifuge pada conical tube selama 4 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan yang
terbentuk dibuang kemudian ditambahkan PBS dingin sebanyak 1 mL. Dilakukan resuspensi dan 1 mL cairan di dalam conical tube dipindahkan kedalam eppendorf
1 mL. Eppendorf disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. c. Pembuatan reagen Annexin V Fluos
Eppendorf dibungkus dengan alumunium foil, diambil 550 mL buffer dan dimasukkan dalam eppendorf, ditambahkan reagen Annexin V Fluos 10 µL
lalu di vortex dan ditambahkan reagen Pi 10 µL, di vortex kembali. Setiap 100 µL larutan uji digunakan 2 µL reagen Annexin V Fluos dan 2 µL reagen Pi.
d. Perlakuan sampel dengan reagen Annexin V Fluos Supernatan pada sampel dibuang dan disisakan endapan yang terbentuk,
ditambahkan 100 µL reagen Annexin V Fluos yang telah dibuat kedalam endapan sampel. Dilakukan inkubasi selama 10 menit dalam ruang gelap laci.
Ditambahkan buffer 300 µL didalam eppendorf kemudian dilakukan analisis. Roche, 2008.
