4. Pencucian
Pencucian daun lavender dilakukan dengan menggunakan air mengalir sebanyak tiga kali, pencucian dilakukan dengan hati–hati supaya daun lavender
tetap dalam kondisi utuh.
5. Pembuatan serbuk daun lavender kering
Daun lavender yang telah dicuci bersih dilakukan pengeringan suhu rendah dengan cara dimasukkan ke dalam lemari pendingin pada suhu 5-10
C selama 14 hari, daun yang telah kering tersebut kemudian dibuat dalam bentuk
serbuk dengan cara diblender hingga hancur dan diperoleh serbuk halus simplisia.
6. Pembuatan ekstrak etanol daun
Lavandula officinalis Chaix
Sebanyak 10 gram serbuk simplisia dilarutkan dengan 50 mL etanol 70 dalam erlenmeyer, kemudian dilakukan pengadukan dan dilanjutkan dengan
maserasi selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm. Hasil maserasi yang diperoleh selanjutnya disaring dan diambil bagian cairan, kemudian dilakukan
rotary evaporator pada suhu 80 C selama 5 menit dilanjutkan dengan pemekatan
dengan menggunakan waterbath selama 4,5 jam pada suhu yang sama, yaitu 80 C
hingga diperoleh hasil ektraksi dengan konsistensi kental berwarna hijau pekat. Hasil ekstraksi yang diperoleh ditimbang, ditempatkan dalam flakon, dan
disimpan pada suhu ruang Hajhashemi, dkk., 2003.
7. Pembuatan larutan uji
a. Sampel ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix Ekstrak kental ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan kedalam
100 µl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000
µg mL. Selanjutnya dibuat delapan seri kadar pengenceran yaitu 1585 µgmL; 1150 µgmL; 1000 µgmL; 562 µgmL; 300 µgmL; 178 µgmL; 100 µgmL; dan
10 µgmL. b. Kontrol positif Tablet tamoxifen
Larutan kontrol positif menggunakan tamoxifen dari 20 tablet Nolvadex yang tiap tabletnya mengandung 20 mg tamoxifen, ditimbang kemudian digerus
hingga homogen. Sebanyak 10 mg dilarutkan dalam DMSO 100 µL, didapatkan larutan stok kontrol dengan konsentrasi 100.000 µg mL. Selanjutnya dibuat tujuh
seri kadar pengenceran yaitu 1585 µgmL; 1150 µgmL; 1000 µgmL; 300 µgmL; 178 µgmL; 100 µgmL; dan 10 µgmL Setiawati, dkk., 2009.
8. Uji Sitotoksik ekstrak etanol daun Lavender pada sel T47D
a. Perlakuan sel T47D Sel T47D yang telah diinkubasi selama 24 jam dikeluarkan dari
inkubator dan dipindahkan menuju LAF Laminar Air Flow, seluruh kegiatan uji sitotoksik dilakukan didalam LAF yang sebelumnya telah diberi penyinaran UV
Ultra Violet. Selanjutnya, seluruh media didalam well-plate dibuang dan ditiriskan, lalu segera dipipet 100 µL sampel dari setiap seri kadar dan
dimasukkan kedalam lubang well-plate, dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Didalam satu well-plate yang berisi 96 lubang diisi oleh sampel, kontrol sel,
kontrol positif tablet tamoxifen. Selanjutnya, sel diinkubasi selama 24 jam didalam inkubator dan setelah inkubasi dilakukan pengamatan pada sel yang telah
diberi perlakuan sampel dibawah mikroskop inverter, tidak semua lubang diamati, hanya diambil beberapa lubang yaitu pada konsentrasi tertinggi, tengah dan
terendah, bentuk sel diamati dan diambil gambar dengan menggunakan kamera digital.
b. Metode MTT Seluruh reagen MTT dipersiapkan dengan cara mencampur 1 mL MTT
dengan 10 mL MK kedalam conical tube, digojog secara perlahan karena sangat mudah berbuih. Selanjutnya, media yang terdapat pada sel T47D perlakuan
dibuang dengan membalikan plate 180 diatas tempat pembuangan dengan jarak
10 cm kemudian tekan plate secara perlahan diatas tisu untuk meniriskan sisa cairan. Larutan PBS dimasukkan sebanyak 100 µL kedalam semua sumuran yang
telah berisi sel untuk mencuci sisa media yang masih bercampur dengan sel, kemudian buang PBS dengan cara membalik plate seperti perlakuan diatas.
Ditambahkan reagen MTT yang telah dipersiapkan sebelumnya sebanyak 100 µL ke setiap sumuran, termasuk kontrol media, dilakukan inkubasi selama empat jam
didalam inkubator CO
2
. Setelah itu, diamti kondisi sel dan formazan yang terbentuk dibawah mikroskop inverted, jika formasan telah terbentuk,
ditambahkan 100 µL SDS 10 dalam 0,1N HCl. Plate dibungkus menggunakan alumunium foil dan diinkubasi pada tempat gelap selama semalam pada suhu
kamar. American Type Culture Collection, 2011.
c. ELISA Reader ELISA reader dihidupkan dan ditunggu hingga proses regressing selesai.
Pembungkus plate dan tutup plate dibuka kemudian plate dimasukkan kedalam ELISA reader, absorbansi yang diperoleh dibaca pada λ= 595 nm, ditekan tombol
start. ELISA reader dimatikan, kertas hasil pembacaan menggunakan ELISA reader di fotocopy dan ditempel pada logbook. Data yang diperoleh diolah untuk
mendapatkan nilai IC
50
dengan membuat grafik absorbansi versus konsentrasi menggunakan program Microsoft Excell serta dilanjutkan dengan program R.
Persentase sel yang hidup dihitung dengan rumus: Persentase sel hidup =
X 100 Doyle dan Griffiths, 2000.
9. Uji apoptosis Annexin V Fluos
a. Perlakuan sel
Penanaman sel T47D dilakukan pada 6 well-plate, tiap sumuran diisi dengan 2 mL. Jumlah sel sekitar lima ratus ribu hingga satu juta sel. Diinkubasi
selama 24 jam didalam inkubator CO
2
. Selanjutnya, plate sel yang telah diinkubasi diambil dan dimasukkan dalam LAF, seluruh media dalam sumuran
disedot menggunakan micropipet dan dibuang. Selanjutnya dicuci PBS sebanyak satu kali, PBS disedot kembali menggunakan micropipet. Sampel pada
konsentrasi IC
50
dimasukkan dalam well-plate sebanyak 2 mL. Kemudian diinkubasi selama 24 jam.
b. Pra Perlakuan Annexin V Fluos Well-plate yang telah diinkubasi dengan sampel diambil dan disiapkan
conical tube untuk memindahkan media yang ada pada well-plate kedalam conical tube.sesuai dengan jenis masing- masing sampel yang ada, termasuk
kontrol sel. Well-plate yang telah kosong dicuci menggunakan PBS sebanyak 1 mL. Kemudian, PBS ditarik kembali menggunakan micropipet dan dimasukkan
Kategori