Tabel II. Viabilitas sel kanker payudara T47D dengan perlakuan tamoxifen.
Konsentrasi µM
Viabilitas Sel x,ˉ ± SD
V1 V2
V3
1000 4,233
5,163 4,698
4,698 ± 0,465 100
1,910 2,375
2,530 2,272 ± 0,322
10 107,537
106,763 102,891
105,731 ± 2,489 1
105,834 100,568
92,514 99,639 ± 6,708
0,1 103,210
105,524 104,440
104,388 ± 1,162 0,01
88,952 100,258
93,908 94,373 ± 5,667
Data tamoxifen menunjukkan hasil yang sama, yaitu bahwa semakin
tinggi konsentrasi tamoxifen, persentase viabilitas sel kanker payudara T47D mengalami penurunan. Tamoxifen tergolong dalam terapi hormonal yang
digunakan pada pasien penderita kanker payudara, mekanisme aksi tamoxifen diketahui dapat melalui dua aksi, yaitu 1 melakukan kompetisi dengan 17β-
estradiol E2 pada lokasi reseptor untuk memblok peran promosi E2 pada kanker payudara; dan 2 dengan mengikat DNA setelah aktivasi metabolik Yu dan
Bender, 2001. Tamoxifen merupakan senyawa yang memiliki aktivitas antiestrogen dan menjadi inhibitor kompetitif bagi estrogen yang berikatan pada
reseptornya Osborne, 1998. Apabila tamoxifen berikatan dengan ERα maka ligand-activated transcription factor yang melakukan regulasi transkripsi pada
nukleus berikatan dengan Estrogen Response Element ERE dan mempengaruhi aktivitas protein coregulator sehingga proliferasi dari estrogen dapat dihambat
Deroo dan Korach, 2006
Gambar 9. Morfologi sel T47D A kontrol sel ; B ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix
1585 µgmL; C ekstrak lavender 300 µgmL; D ekstrak lavender 10 µgmL; E tamoxifen sel hidup: ;sel mati:
Morfologi sel kanker payudara T47D diamati dibawah mikroskop inverter dan memberikan gambaran
bahwa sel yang mati memiliki warna lebih gelap dan berbentuk bulat, hal ini terjadi karena sel kehilangan sitoplasma akibat
rusaknya membran sel, sehingga sel tidak dapat meneruskan cahaya dari mikroskop. Sedangkan untuk sel yang masih hidup ditunjukkan dengan bentuk
yang lebih lonjong dan warna terang. Perubahan morfologi sel perlu dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui
kemampuan ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix dalam menginduksi apoptosis sel kanker payudara T47D pada konsentrasi IC
50.
C. Uji Apoptosis Ekstrak Etanol Daun
L. Officinalis Chaix dengan Metode Annexin V Fluos
Metode Annexin V Fluos digunakan dalam penelitian ini untuk mengetahui jalur kematian sel akibat pemberian ekstrak etanol daun L. Officinalis
Chaix. Metode ini dipilih karena dapat memberikan hasil kuantitatif yang cepat untuk mengetahui jumlah sel yang mengalami apoptosi melalui flow cytometer
dan dapat membedakan sel yang mengalami nekrosis maupun sel yang mengalami apoptosis menggunakan reagen Annexin V Fluos dan Propidium Iodin Pi.
Mekanisme kematian sel dapat dibagi menjadi dua yaitu melalui mekanisme apoptosis dan nekrosis, proses kematian sel melalui mekanisme apoptosis penting
digunakan sebagai indikasi selektifitas ekstrak etanol daun L.officinalis Chaix sebagai agen kemopreventif. Mekanisme kematian sel dapat dilihat dari
persentase total sel di setiap kuadran dengan menggunakan metode Annexin V Fluos. Hasil Annexin V Fluos kemudian dianalisis menggunakan alat bernama
FACSCalibur Gambar 10
Gambar 10. Hasil pembacaan flow cytometer: A Kontrol sel; B Ekstrak etanol daun
L.officinalis Chaix; C Tamoxifen
Tabel III. Persentase jumlah sel kanker payudara T47D pada setiap kuadran
Kontrol sel Ekstrak etanol
daun L.officinalis
Chaix Tamoxifen
Kuadran I Sel hidup
91,85 5,51
4,55
Kuadran II Early
apoptosis
6,24 25,27
65,61
Kuadran III Late
apoptosis
1,75 52,83
27,62
Kuadran IV Nekrosis
0,21 16,62
2,38
Pada kuadran satu dengan warna hijau Gambar 10 menunjukkan jumlah sel yang hidup, kuadran dua dengan warna kuning menunjukkan jumlah
sel yang mengalami apoptosis tahap awalearly apoptosis, kuadran tiga dengan warna merah muda memberikan gambaran mengenai jumlah sel yang telah
mengalami apoptosis, sedangkan untuk kuadran empat menunjukkan total sel yang mengalami nekrosis. Sistem pembagian kuadran mengacu pada penelitian
Nurzijah dkk. 2012. Gambaran hasil flow cytometer mengindikasikan bahwa kematian sel
kanker payudara T47D yang disebabkan karena pemberian ekstrak etanol daun L. Officinalis Chaix mengarah pada mekanisme apoptosis, karena sebanyak 25, 27
dari total sel menempati kuadran dua yang menandakan telah terjadi tahapan apoptosis awal, sedangkan sel yang mengalami late apoptosis sebanyak 52,83
dari total sel, sehingga total sel yang mengalami apoptosis adalah sebesar 78,10 dari total sel. Jalur pemacuan apoptosis oleh ekstrak etanol daun L. Officinalis
Chaix diprediksikan melalui jalur intrinsik karena dalam penelitian yang dilakukan oleh Liston dkk. 2013, monoterpen dapat mempengaruhi interaksi
interseluler dalam menginduksi sel kanker. Pada jalur intrinsik, protein caspase 3 memiliki peran aktif dalam memecah berbagai substrat, diantaranya enzim DNA
untuk mengaktifkan caspase yang lain yang memberikan amplifikasi terhadap kerusakan seluler, adanya kerusakan seluler meningkatkan ekspresi dari protein
p53 yang menyebabkan terjadinya apoptosis. Kedua perlakuan baik tamoxifen maupun ekstrak etanol daun L.
Officinalis Chaix menunjukkan bahwa pada konsentrasi IC
50
yang digunakan, sel
yang mati melebihi 50, hal ini dapat diakibatkan karena waktu inkubasi sel yang melebihi 24 jam, sehingga banyak sel yang telah mengalami kematian sebelum
dilakukan uji Annexin V Fluos. Setelah dilakukan uji Annexin V Fluos terhadap ekstrak etanol daun L.
Officinalis Chaix, analisis efek antikanker dilanjutkan menggunakan metode imunositokimia untuk mengetahui interaksi molekuler ekstrak etanol daun L.
Officinalis Chaix terhadap ERα.
D. Uji Ekspresi ERα menggunakan Metode Imunositokimia
Metode imunositokimia digunakan untuk mengetahui adanya ekspresi suatu protein spesifik dengan menggunakan antibodi spesifik yang berikatan
dengan protein, pada penelitian ini antibodi primer yang digunakan adalah estrogen alfa. Antibodi ini berikatan dengan reseptor ERα yang ada di sel kanker
payudara T47D sehingga sel tersebut dapat mengekspresikan reseptor estrogen dengan memberikan warna coklat ketika diberi pewarna DAB dari reagen
imunositokimia. Pada penelitian ini digunakan metode imunositokimia indirect tidak
langsung yang dapat memberikan hasil lebih sensitif karena antibodi primer dikenali oleh antibodi sekunder yang berikatan kovalen dengan marker sebagai
penanda sehingga membuatnya mudah terdeteksi Albert, dkk., 1994.
Gambar 11. Morfologi ekspresi estrogen sel T47D A Kontrol sel dengan pemberian antibodi; B Kontrol sel tanpa antibodi; C perlakuan ekstrak etanol daun
L. Officinalis Chaix pada IC
50
; D perlakuan tamoxifen mengekspresikan ERα: ; tidak mengekspresikan ERα:
Berdasarkan pengamatan, kontrol sel dengan pemberian antibodi memiliki sel dengan warna sitoplasma coklat bagian pinggir, warna coklat pada
sel terjadi karena pewarna DAB yang bereaksi dengan H
2
O
2
dari HRP, sehingga menimbulkan warna coklat, sedangkan HRP berikatan pada antibodi primer dan
antibodi sekunder yang aktif bekerja pada ERα. Sedangkan pada pengamatan sel dengan pemberian ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix memberikan warna
biru atau ungu pada sel, hal ini dikarenakan ekstrak etanol daun L. officinalis Chaix menghambat ikatan antibodi primer estrogen alfa dengan ERα pada sel
T47D, sehingga ERα tidak diekspresikan dan pewarna Mayer yang memberikan warna ungu pada sel. Selanjutnya distribusi ekspresi ERα dapat diketahui dan
dihitung menggunakan metode scoring system. Metode ini memberikan gambaran terkait level ekspresi ERα dengan menghitung jumlah sel T47D yang
mengekspresikan ERα dari tiga lapang pandang yang berbeda saat dilakukan pengamatan di bawah mikroskop Vang, dkk., 2006. Mekanisme perhitungan sel
