Pembuatan ekstrak etanol daun Pembuatan larutan uji

ke dalam conical tube yang sesuai dengan tiap sampel. Selanjutnya, dimasukkan tripsin kedalam well-plate sebanyak 200 µL, diinkubasi selama 3 menit, dan diamati menggunakan mikroskop hingga terlihat bentuk bulat transparan yang menunjukkan sel T47D. Ditambahkan MK sebanyak 1 mL kedalam plate, lalu disedot kembali dan ditampung pada conical tube. Dilakukan sentrifuge pada conical tube selama 4 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan yang terbentuk dibuang kemudian ditambahkan PBS dingin sebanyak 1 mL. Dilakukan resuspensi dan 1 mL cairan di dalam conical tube dipindahkan kedalam eppendorf 1 mL. Eppendorf disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. c. Pembuatan reagen Annexin V Fluos Eppendorf dibungkus dengan alumunium foil, diambil 550 mL buffer dan dimasukkan dalam eppendorf, ditambahkan reagen Annexin V Fluos 10 µL lalu di vortex dan ditambahkan reagen Pi 10 µL, di vortex kembali. Setiap 100 µL larutan uji digunakan 2 µL reagen Annexin V Fluos dan 2 µL reagen Pi. d. Perlakuan sampel dengan reagen Annexin V Fluos Supernatan pada sampel dibuang dan disisakan endapan yang terbentuk, ditambahkan 100 µL reagen Annexin V Fluos yang telah dibuat kedalam endapan sampel. Dilakukan inkubasi selama 10 menit dalam ruang gelap laci. Ditambahkan buffer 300 µL didalam eppendorf kemudian dilakukan analisis. Roche, 2008.

10. Imunositokimia

a. Perhitungan sel Sel yang berada di dalam cawan petri diberi MK hingga memenuhi permukaan cawan. MK diambil dan dimasukkan dalam conical tube. Cairan sel diambil sedikit dan dituang diatas kaca preparat untuk menghitung jumlah sel. Kaca preparat diletakan diatas Haemositometer alat penghitung sel, kemudian diamati menggunakan mikroskop inverter perbesaran 10 kali dan dilakukan penghitungan dengan bantuan counter. Sel sudah sesuai dengan kriteria apabila jumLahnya antara minimal 50.000- 100.000 sel, jika hasil perhitungan sel sudah sesuai maka dilanjutkan dengan preparasi sel tersebut. Dimasukka 5 mL MK kedalam conical tube yang baru dan ditambahkan 1,25 mL sel dari conical tube awal kedalam conical tube yang berisi 5 mL MK. b. Subkultur sel Cover slip dimasukkan ke dalam well plate sesuai dengan jumlah sampel dan kontrol yang digunakan. Campuran MK dan sel yang ada di conical tube dimasukkan pada 24 well-plate yang telah diisi coverslip sebanyak 1 mL. Inkubasi dilakukan selama 24 jam didalam inkubator CO 2 . c. Perlakuan MK yang ada di dalam well plate disedot kemudian diisi dengan sampel sebanyak 1 mL. Di dalam well plate juga diberi kontrol sel, kontrol positif, dan kontrol negatif.