Bahan kimia yang digunakan antara lain pelarut organik p.a metanol, etilasetat, kloroform, heksana, petroleum benzena, difenilpikril hidrazil DPPH,
bahan-bahan kimia dan reagen untuk identifikasi golongan senyawa bahan aktif dan berbagai pelarut organik untuk pemisahan dengan KLT, kolesterol Sigma
Chemical Co., kit penentuan kadar kolesterol total, trigliserida, HDL dan LDL, formalin, parafin, pewarna HE dan air destilata, simvastatin penurun kolesterol,
sulfamix antikoksidia, albendazol obat cacing, ivermectin obat tungauskabies.
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap yang meliputi: 1 Persiapan dan pengambilan contoh lintah laut ke Pulau Buton.
2 Ekstraksi bahan aktif antioksidan dengan metode Quinn. 3 Identifikasi golongan senyawa ekstrak terpilih dengan pereaksi standar.
4 Uji aktivitas antioksidan ekstrak kasar dengan metode NBT dan DPPH Molyneux 2004
5 Uji khasiat bubuk lintah laut kering pada hewan percobaan in vivo meliputi antikolesterol dan antiaterogenik.
6 Uji efek toksikopatologis terhadap jaringan organ pembuluh darah jantung, ginjal dan hati kelinci percobaan
3.3.1 Tahap persiapan contoh
Contoh yang digunakan dalam penelitian ini adalah lintah laut yang dipersiapkan dalam bentuk tepung kering sehingga mudah dalam penyimpanan
dan pencampuran dengan pakan standar sesuai konsentrasi yang diperlukan. Contoh diambil dalam keadaan hidup dari perairan pantai Pulau Buton. Contoh
lintah laut hidup dimatikan dengan cara disiram air panas dan dicuci bersih dengan air tawar kemudian dijemur beberapa hari sampai kering dengan kadar air
kurang dari 15. Contoh kering dikemas dengan kemasan plastik dan dibawa ke laboratorium Bogor disimpan pada suhu rendah kurang dari 10 °C.
3.3.2 Analisis proksimat
Lintah laut laut kering diuji komposisi kimianya yang terdiri atas kadar air, protein, lemak, abu, abu tak larut asam dan karbohidrat dengan cara by difference
sesuai metode AOAC 1995.
3.3.3 Analisis logam berat
Logam berat yang dianalisis adalah merkuri Hg, timbal Pb dan kadmium Cd. Metode analisis dilakukan berdasarkan SNI 06-6992.2-2004 untuk merkuri
dan SNI 06-6989.46-2004 untuk timbal dan kadmium. Tahap destruksi dilakukan menurut Cantle 1982. Contoh lintah laut kering sebanyak 1 g dimasukkan ke
dalam erlenmeyer 100 ml ditambahkan 5 ml HNO
3
pekat didiamkan selama 1 jam pada suhu ruang di ruang asam. Contoh dipanaskan di atas hot plate selama
4-6 jam, kemudian dibiarkan 24 jam dengan kondisi tertutup. Setelah itu ditambahkan 0,4 H
2
SO
4
dan dipanaskan selama 1 jam di atas hot plate sampai larutan pekat. Ditambahkan 2-3 tetes HCLO
4
:HNO
3
2:1 sampai terjadi perubahan warna dari coklat menjadi kuning tua dan muda bening. Setelah terjadi
perubahan warna pemanasan masih dilanjutkan selama 10-15 menit. Contoh dipindahkan dan didinginkan dan ditambahkan 2 ml akuades dan 0,6 ml HCl
pekat
.
Kemudian dipanaskan kembali selama 15 menit dan dimasukkan kedalam labu takar 100 ml. Jika ada endapan larutan contoh disaring dengan kertas saring.
Contoh siap untuk dianalisis logam beratnya menggunakan SSA
Spektrofotometer Serapan Atom. 3.3.4 Ekstraksi bahan aktif antioksidan dan antikolesterol dari lintah laut
Penghitungan rendemen antioksidan dari ekstrak kasar lintah laut kering. Ekstraksi bahan aktif yang digunakan adalah ekstraksi bertingkat berdasarkan
metode Quinn dan Gadek 1981 yang disitir Darusman et al. 1995 dan dimodifikasi. Modifikasi dilakukan terhadap waktu maserasi yaitu 3x24 jam,
sedangkan Quinn 1x24 jam. Pelarut yang digunakan adalah klorofom non polar, etil asetat semi polar dan metanol polar.
Lintah laut kering sebanyak 50 gram dihaluskan dan ditambahkan pelarut kloroform 100 ml sampai terendam, dimaserasi pada suhu ruang selama 3x24 jam,
kemudian disaring dan diperoleh filtrat 1. Residunya ditambah dengan etil asetat sampai terendam dan dimaserasi selama 3x24 jam pada suhu ruang, kemudian
disaring, dari hasil ini diperoleh filtrat 2. Residu yang tersisa ditambah dengan metanol sampai terendam dan dimaserasi selama 3x24 jam pada suhu ruang,
kemudian disaring dan diperoleh filtrat 3. Filtrat 1,2 dan 3 yang dihasilkan
dievaporasi hingga diperoleh ekstrak kasar dalam bentuk pasta atau kering. Metode ekstraksi dan evaporasi lintah laut kering disajikan pada Gambar 4.
3.3.5 Identifikasi golongan senyawa bioaktif lintah laut 1 Uji Alkaloid
