Tabel 4 Perlakuan pada uji aktivitas antioksidan Reagen
Sampel S Blanko B Sampel-Blanko
Blanko-Blanko Enzim 250,0
µl 250,0 µl -
- NBT-Xa 250,0
µl 250,0 µl 250
,0 µl 250,0
µl Sampel 12,5
µl - 12,5 µl -
DMSO - 12,5 µl - 12,5
µl Blanko -
- 250,0 µl 250,0
µl
Keterangan: NBT-Xa = Nitroblue tetrazolium-xantin DMSO = Dimetil sulfoksida
Blanko = Buffer fosfat
Tabung sampel S, blanko B, sampel-blanko BS, blanko-blanko B dibuat dua kali ulangan. Tabung- tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 menit. Kemudian ke dalam tiap tabung ditambah sodium dodesil sulfat
SDS sebanyak 500 µl. Setelah itu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 560 nm dengan larutan standard BB dan diperoleh data ES sebagai
absorbansi sampel S dan EB sebagai absorbansi blanko, ESB sebagai absorbansi sampel-blanko, dan EBB sebagai absorbansi blanko-blanko. Selanjutnya dihitung
aktivitas SOD atau persentase penghambatan terhadap radikal bebas menggunakan rumus sebagai berikut:
Ativitas SOD =
3.3.8 Uji khasiat dan efek toksikopatologis bubuk lintah laut kering pada hewan percobaan
Hewan percobaan diberikan kolesterol dosis tinggi sehingga diharapkan terjadi hiperkolesterolemia. Bersamaan dengan itu hewan percobaan juga
diberikan bubuk lintah laut kering untuk melihat peran atau potensinya dalam menekan atau menurunkan kolesterol. Selanjutnya juga dilihat kemampuannya
dalam mencegah atau menekan terbentuknya lesi aterosklerosis dengan mengamati pembuluh darah jantung, sel hati dan ginjal kelinci yang mengalami
perubahan.
Pada tahap penelitian ini digunakan kelinci 16 ekor masing-masing ditempatkan dalam satu kandang. Kelinci yang digunakan adalah jenis New
Zealand White jantan berumur 4-5 bulan yang diperoleh dari Balai Penelitian
Ternak Ciawi Bogor. 100
× −
− −
− EBB
EB ESB
ES EBB
EB
Uji pada hewan percobaan
Pada tahap ini semua kelinci diberi ransum standar dan minum ad libitum selama 2 minggu. Sebelumnya berat kelinci ditimbang untuk mendapatkan
gambaran awal berat badan kelinci. Selama periode adaptasi setiap kelinci diamati satu persatu kebiasaan makan, kondisi kesehatan, dan faktor lainnya yang
dapat mempengaruhi keadaan kelinci sehingga dapat dikendalikan pada pengujian selanjutnya. Ransum kelinci yang diberikan adalah ransum standar jenis Rb 12
yang diproduksi oleh Balai Penelitian Ternak Ciawi Bogor. Komposisi ransum standar disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5 Komposisi ransum standar Rb-12 dalam 100kg No Bahan
Jumlah kg
1 Tepung ikan
2 2 Bungkil
kedelai 18
3 Bungkil kelapa
7 4 Jagung
20,5 5 Dedak
12,7 6
Pollard dedak gandum 10,5
7 Rumput gajah keringdaun tebu
22 8 Minyak
sayur 3
9 Molase 2
10 Top mix vitamin dan mineral
0,3 11 Garam
dapur 0,3
12 Kapur kalsium karbonat
0,5 13
Tepung tulang dikalsium fosfat 0,5
14 Susu skim
0,5 15
Natrium dikalsium fosfat 0,2
Untuk mencegah terjadinya stres pada kelinci karena transportasi, maka kelinci yang baru datang dipuasakan selama sehari, hanya diberi air gula 5.
Kemudian diberi pakan standar 2 kali sehari sebanyak 50 gram dan sisanya ditimbang. Setelah diperoleh jumlah pakan optimal selama seminggu, untuk
seterusnya pemberian pakan dilakukan satu kali sehari sebanyak 100 gram demikian juga dengan pembersihan kandang.
Awal masa adaptasi semua kelinci diberi obat antikoksidia sulfamix dengan cara pemberian sesuai label yaitu 3-2-3 3 hari berturut-turut diberi sesuai
label, 2 hari istirahat dan 3 hari berikutnya diberi lagi. Pada dua hari istirahat antikoksi diberi obat cacing Albendazol dengan dosis sesuai label pada
kemasan.
Kandang kelinci dan peralatan lainnya, kandang yang ditempati masing- masing kelinci berukuran 50x50x45 cm
3
yang dilengkapi dengan tempat air minum dan ransum serta penampungan feses dan urin. Alat bantu lainnya seperti
tempat kelinci pada waktu pengambilan darah dan penimbangan, timbangan kelinci, perlengkapan pengambilan darah serta wadah penyimpanannya.
Pada akhir masa adaptasi masing-masing kelinci ditimbang untuk mengetahui beratnya dan diambil darahnya dari telinga. Sebelum pengambilan
darah, kelinci dipuasakan selama 12 jam. Kelinci dijadikan 4 kelompok yang masing-masing terdiri dari 4 ekor. Proses percobaan menggunakan hewan
kelinci dapat dilihat pada Gambar 5. Pemberian dosis tepung lintah laut berpedoman pada hasil uji aktivitas
antioksidan yang telah dilakukan secara in vitro. Hasil diperoleh melalui konversi sehingga diperoleh dosis yang sesuai. Pada akhir pengujian, kelinci dimatikan
dengan cara disembelih, menggunakan pisau tajam. Setelah darah dikeluarkan, kelinci dibedah dan dipisahkan hati, jantung dan ginjal, lalu difiksasi dalam
formalin 10 selama 24 jam. Setelah difiksasi hati, pembuluh darah jantung dan ginjal diiris kurang lebih
3 mm dan dilakukan proses dehidrasi menggunakan alkohol dengan konsentrasi bertingkat 70, 80, 90, dan 95 selama 8 jam, dilanjutkan dengan alkohol absolut
I, II, III masing-masing selama 2 jam. Selanjutnya potongan organ dijernihkan menggunakan xylol I dan II masing-masing 2 jam. Tahap selanjutnya potongan
organ diinfiltrasi dengan parafin. Proses ini dilakuakan secara otomatis dengan mesin tissue processor dan tissue embedding console. Setelah jaringan mengeras,
blok jaringan dipotong menggunakan mikrotom dengan ketebalan 4-5 mikron dan dilekatkan pada gelas objek.
Pewarnaan Hematosiklin Eosin HE dilakukan untuk melihat morfologi jaringan pembuluh darah aorta, hati, dan ginjal. Pewarnaan diawali dengan
deparafinasi dan dehidrasi. Pewarnaan dengan HE selama 30 menit dan Eosin selama 2 menit. Setelah diwarnai sediaan dikeringkan terlebih dahulu sebelum
ditetesi perekat Permount® dan kemudian ditutup dengan gelas penutup. Preparat siap untuk diamati menggunakan mikroskop cahaya.
Gambar 5 Proses pengujian pada hewan percobaan
Kontrol negatif
Ransum
Kontrol positif
Ransum Kolestrol 0,2
Obat Simvastatin
0,625 mg
Ransum Kolestrol 0,2
Lintah laut Dosis 4
Ransum Kolestrol 0,2
Kelinci Uji Kelinci Uji Kelinci Uji
Kelinci Uji 3 Ekor 3 Ekor 3 Ekor 3 ekor
- 2 4
8 12
Minggu ke-
Adaptasi Periode Pengujian
Euthanasi dan pengambilan
sampel organ
Pengamatan:
• Histopatologi hati, ginjal • Lesi Aterosklerosis
• SGOT dan SGPT darah
Pengamatan peubah pada • Berat badan
• Konsumsi Ransum • Total Kolestrol
• Trigliserida • Kolestrol HDL
• Kolestrol LDL
Lintah laut kering Ekstraksi bertingkat
Pengujian aktivitas antioksidan dan rendemen
Gambar 6 Diagram alir penelitian utama Pengamatan histopatologi dititikberatkan pada perubahan struktur dinding
pembuluh darah yang ditandai dengan adanya endapan sel lemak sampai terbentuknya plak aterosklerosis. Ketebalan dan luas plaklesi yang terbentuk
diamati dan diberikan skornilai 3 untuk yang tebal sekali, 2 agak tebal, 1 tipis dan 0 normal. Pemberian diet aterogenik yang berisi kolesterol sebesar 0,2 dari berat
ransum total yang dikonsumsi 0,2 g kolesterol100 g ransum dimaksudkan supaya kelompok kontrol positif mengalami aterosklerosis yang ditandai oleh
tingginya kadar kolesterol total dan LDL serum serta terbentuknya lesiplak pada aorta kelinci. Penetapan pemberian dosis 0,2 berdasarkan penelitian Azima
2004, pada dosis 0,1 telah mampu meningkatkan kadar kolesterol selama 12 minggu. Adapun masing-masing kelompok kelinci diperlakukan sebagai
berikut: 1 Kontrol negatif hanya diberikan ransum standar
Uji in vivo pada kelinci Kontrol negatif = ransum Rb 12
Kontrol positif = ransum Rb 12+kolesterol 0,2
Obat = Rb 12+kolesterol 0,2+ simvastatin 0,625 mgekorhari
Discodoris = Rb 12 +kolesterol 0,2+Discodoris 4
Periode Pengujian -2
4 8 dan 12 minggu
Pengamatan Berat badan, sisa pakan, profil lipid darah: kolesterol total, trigliserida, HDL,
LDL, SGOT dan SGPT
2 Kontrol positif diberikan ransum standar dan kolesterol 0,2 3 Perlakuan obat Simvastatin 0,625 mg, ransum standar, kolesterol 0,2
4 Perlakuan tepung lintah laut 4 , ransum standar, kolesterol 0,2 Pemberian ransum kelinci sesuai dengan perlakuan selama 12 minggu.
Penimbangan sisa pakan dilakukan setiap hari dan berat badan kelinci setiap 7 hari. Pembuatan pakan dilakukan sekali dalam sebulan dan dikeringkan dioven.
Teknik pemberian pakan untuk semua kelinci diperlakukan sama yaitu ditimbang 100 gram perekor perhari, kecuali untuk perlakuan lintah laut ditambah 4.
Sisanya setiap hari ditimbang. Sebelum diberikan pakan untuk penambahan kolesterol dan obat diberikan terlebih dahulu dengan cara dicekok menggunakan
syringe. Pemberian air minum dilakukan secara ad libitum. Selama pengujian dilakukan pengamatan terhadap peubah berat badan,
konsumsi ransum, total kolesterol, trigliserida, HDL dan LDL pada minggu ke 0, 4, 8, dan 12. Pada minggu ke 12 juga dilihat kadar SGOT dan SGPT.
Pengambilan contoh darah dilakukan setiap 4 minggu. Darah diambil pada pembuluh darah vena telinga kelinci sebanyak 3 ml. Darah didiamkan selama
30 menit pada suhu ruang, kemudian disentrifus untuk memisahkan serumnya pada kecepatan 2.700 rpm selama 10 menit dan profil lipidnya ditentukan.
Profil lipid serum ditentukan dengan metode enzim cholesterol oxsidase-p- aminophenozone CHOD-PAP untuk kolesterol total, metode pengendapan untuk
HDL dan LDL, dan metode glycerol phosphate oxidase-p-phenozone GPO-PAP untuk trigliserida.
SGOT dan SGPT hanya dianalisis pada minggu ke 12 percobaan dengan metode kit AMP Medizintechnik Hamdles GmbH, hal ini dilakukan untuk melihat
pengaruh pemberian obat simvastatin dan Discodoris sp terhadap enzim-enzim tersebut dan kerja hati.
Kelainan pada organ hati dihitung dari jumlah sel yang mengalami kerusakan pada 5 lapangan pandang kemudian dipersentasekan normal,
degenerasi hidropis, degenerasi lemak dan sel yang mati. Pembentukan plak pada pembuluh darah jantung diamati ketebalannya dan dibandingkan dengan kontrol
negatif. Endapan protein yang terdapat pada glomerulus ginjal dihitung dan diuji secara statistik.
3.3.9 Analisis statistik
