3 Uji Saponin uji busa
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Sebanyak 1 gram ekstrak kasar ditambah air secukupnya dan dipanaskan pada air mendidih selama
5 menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok. Timbulnya busa yang bertahan lebih dari 10 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2N
menunjukkan adanya saponin. 4 Uji Molisch
Sebanyak 1 ml larutan sampel diberi 2 tetes pereaksi molisch dan 1 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung. Uji positif yang menunjukkan adanya
karbohidrat ditandai oleh terbentuknya kompleks berwarna ungu diantara 2 lapisan cairan.
5 Uji Benedict
Larutan sampel sebanyak 8 tetes dimasukkan kedalam 5 ml pereaksi benedict. Campuran dikocok dan dididihkan selama 5 menit. Terbentuknya warna
hijau, kuning atau endapan merah bata menunjukkan adanya gula pereduksi.
6 Uji Biuret
Sebanyak 1 ml larutan sampel ditambah 4 ml pereaksi biuret. Campuran dikocok dengan seksama. Terbentuknya larutan berwarna ungu menunjukkan
hasil uji positif adanya senyawa peptida.
7 Uji Ninhidrin
Sebanyak 2 ml larutan sampel ditambah beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Terjadinya
larutan berwarna biru menunjukkan reaksi yang positif terhadap adanya asam amino bebas.
3.3.6 Uji aktivitas antioksidan ekstrak kasar lintah laut kering DPPH Molyneux 2004
Ekstrak kasar lintah laut yang diperoleh dari proses maserasi dengan metanol, dilarutkan dalam metanol dengan konsentrasi 100, 200, 500, 1000, 2000
dan 4000 ppm. Antioksidan sintetik BHT digunakan sebagai pembanding dengan konsentrasi 5, 10, 25, 50, dan 100 ppm. Larutan pereaksi DPPH yang digunakan
dibuat dengan melarutkan DPPH dalam metanol p.a dengan konsentrasi 1 mM, yang dibuat segar dan dijaga pada suhu rendah serta terlindung dari cahaya.
Sebanyak 4 ml larutan uji atau pembanding direaksikan dengan 1 ml larutan DPPH dalam tabung reaksi. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometri
UV-VIS Hitachi U-2800 pada panjang gelombang 517 nm. Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki aktivitas antioksidan apabila senyawa tersebut mampu
mendonorkan atom hidrogennya yang ditandai oleh perubahan warna ungu menjadi kuning pucat Molyneux 2004. Tingkat diskolorisasi warna ungu DPPH
merupakan indikasi aktivitas penghambatan radikal bebas oleh contoh antioksidan Abdille et al. 2004. Larutan standar dibuat dengan mencampur 4 ml metanol p.a
dengan 1 ml DPPH. Aktivitas antioksidan masing-masing sampel dan BHT dinyatakan dengan persentase penghambatan radikal bebas yang dihitung dengan
rumus: 100
blanko absorbansi
sampel absorbansi
- blanko
absorbansi inhibisi
× =
Nilai konsentrasi dan hambatan ekstrak diplot masing-masing pada sumbu x dan y. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y = bLnx + a digunakan
untuk mencari nilai IC inhibitor concentration, dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x sebagai IC
50
. Nilai IC
50
menyatakan konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk mereduksi DPPH sebesar 50.
3.3.7 Uji aktivitas antioksidan ekstrak kasar lintah laut kering metode NBT
Uji aktivitas antioksidan ekstrak kasar yang diperoleh menggunakan metode nitroblue tetrazolium NBT dengan kit pereaksi superoksida dismutase SOD
seperti yang dilakukan Purwadiwarsa et al. 2000. Bahan yang diperlukan dalam uji aktivitas antioksidan adalah buffer fosfat 0,1 M pH 7,5; xantin 0,40 mmoll;
nitroblue tetrazolium NBT 0,24 mmoll Bahan 1. Enzim xantin oksidase 0,049 unitml Bahan 2. Buffer fosfat 0,1 M pH 7,5 Bahan 3 dan 4 sebagai
pengencer dan blanko. Bahan 5 Sodium dodesil sulfat SDS 69 mmoll dan dimetil sulfoksida DMSO sebagai pelarut sampel.
Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan cara melarutkan contoh ekstrak kasar sebanyak 20 mg dalam 1 ml DMSO dan diambil 12,5 µl. Mikrotube
disiapkan dan diberi perlakuan seperti terlihat pada Tabel 4.
Tabel 4 Perlakuan pada uji aktivitas antioksidan Reagen
Sampel S Blanko B Sampel-Blanko
Blanko-Blanko Enzim 250,0
µl 250,0 µl -
- NBT-Xa 250,0
µl 250,0 µl 250
,0 µl 250,0
µl Sampel 12,5
µl - 12,5 µl -
DMSO - 12,5 µl - 12,5
µl Blanko -
- 250,0 µl 250,0
µl
Keterangan: NBT-Xa = Nitroblue tetrazolium-xantin DMSO = Dimetil sulfoksida
Blanko = Buffer fosfat
Tabung sampel S, blanko B, sampel-blanko BS, blanko-blanko B dibuat dua kali ulangan. Tabung- tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 menit. Kemudian ke dalam tiap tabung ditambah sodium dodesil sulfat
SDS sebanyak 500 µl. Setelah itu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 560 nm dengan larutan standard BB dan diperoleh data ES sebagai
absorbansi sampel S dan EB sebagai absorbansi blanko, ESB sebagai absorbansi sampel-blanko, dan EBB sebagai absorbansi blanko-blanko. Selanjutnya dihitung
aktivitas SOD atau persentase penghambatan terhadap radikal bebas menggunakan rumus sebagai berikut:
Ativitas SOD =
3.3.8 Uji khasiat dan efek toksikopatologis bubuk lintah laut kering pada hewan percobaan
