48 uji kualitatif. Pada uji difusi sumur diukur diameter penghambatan.
Hasilnya kemudian digunakan untuk memilih ekstrak yang akan diuji lebih lanjut. Hasil uji difusi sumur diolah secara statistik. Uji lebih lanjut
yang dilakukan adalah penentuan nilai MIC dan uji fitokimia. Sesuai dengan hasil perhitungan total mikroba pada tahap
persiapan kultur bakteri uji, maka untuk mendapatkan total mikroba yang seragam didalam cawan uji difusi agar sebanyak 1x10
5
, maka kultur harus diencerkan sebanyak 10
-3
. Cara untuk mengencerkan sebanyak 10
-3
kali adalah dengan memasukkan 25 μl bakteri uji kedalam 25 ml agar.
2. Penelitian Lanjutan
Penelitian lanjutan bertujuan untuk mengetahui nilai MIC dan komponen fitokimia yang dimiliki ekstrak kulit kayu mesoyi terpilih.
Ekstrak terpilih adalah ekstrak yang dapat menghambat semua bakteri uji. Ekstrak-ekstrak terpilih didasarkan pada hasil uji difusi sumur secara
kualitatif yang diolah secara statistik. Ekstrak terpilih adalah minyak atsiri dan ekstrak etanol. Penentuan
nilai MIC dilakukan terhadap satu jenis mikroba yang pada uji difusi sumur sebelumnya dapat dihambat paling optimum oleh ekstrak terpilih.
Analisis fitokimia yang dilakukan terhadap kedua ekstrak terpilih adalah analisis secara kualitatif fenol, tanin, saponin, terpenoid, steroid,
flavonoid, dan alkaloid.
D. METODE ANALISIS
Pengujian aktivitas antimikroba ekstrak-ekstrak kayu dilakukan dengan beberapa metode analisis, antara lain: 1 uji difusi sumur, 2
penentuan MIC Minimum Inhibition Concentration, dan 3 uji fitokimia.
1. Perhitungan nilai rendemen
Sejumlah bubuk kulit kayu mesoyi sekitar 30 g dimasukkan kedalam tabung refluks dan diekstraksi selama 3 jam kemudian
49 dilanjutkan selama 2 jam. Cairan ekstrak yang didapat kemudian
dirotavapor dan dihembus gas N
2
untuk menghilangkan pelarut. Setelah didapat ekstrak tanpa pelarut kemudian dapat dihitung rendemennya
dengan rumus berikut ini.
dimana: W
= berat ekstrak g W
= berat bahan yang diekstrak g Ukuran sampel bubuk kulit kayu mesoyi = 40 mesh
2. Uji difusi sumur metode modifikasi Garriga et al., 1993
Pengujian aktivitas antimikroba dilakukan dengan uji difusi sumur. Uji difusi sumur dilakukan 3 kali ulangan dari ekstrak-ekstrak kulit kayu
mesoyi yang sama. Ekstrak-ekstrak kulit kayu mesoyi dilarutkan dalam DMSO dan diuji efektivitasnya terhadap lima mikroba dari jenis bakteri
patogen dan bakteri perusak pangan dengan jumlah total mikroba dalam cawan adalah 1x10
5
hingga 1x10
6
koloniml. Total mikroba dikonfirmasi dengan metode hitungan cawan.
DMSO digunakan sebagai kontrol negatif untuk menghilangkan pengaruh DMSO terhadap mikroba uji. Selain kontrol negatif, digunakan
juga antibiotik amoxycillin sebagai kontrol positif. Antibiotik dilarutkan dalam DMSO pada konsentrasi 0,01.
Kultur yang akan digunakan untuk uji difusi sumur disegarkan terlebih dahulu dengan cara diambil satu ose, lalu ditumbuhkan pada
media pertumbuhan NB 10 ml dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah diinkubasi diambil kembali 1 ml dan dipindahkan kedalam
NB 9 ml untuk kemudian diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama. Dari kultur yang telah disegarkan dan berumur 24 jam diambil sebanyak yang
diperlukan, sesuai dengan hasil perhitungan pada tahapan persiapan kultur sebelumnya nilai A, dan dimasukkan kedalam media agar 25 ml yang
kemudian dituang kedalam cawan petri steril. Rendemen =
WW × 100 ww
50 Agar kemudian dibiarkan membeku. Setelah beku, dibuat
lubangsumur menggunakan alat pembuat sumur. Pengujian dilakukan duplo, karenanya pada setiap satu cawan dibuat 6 lubangsumur. Dua
lubangsumur diisi dengan ekstrak kulit kayu mesoyi, dua lubangsumur lainnya diisi dengan kontrol positif, dan 2 lubangsumur sisanya diisi
dengan kontrol negatif. Cawan uji difusi sumur kemudian disimpan didalam refrigerator selama 30 menit, lalu diinkubasi tidak terbalik pada
suhu 37°C selama 24 jam. Diagram alir uji difusi sumur dapat dilihat pada Gambar 9.
Kultur mikroba yang telah disegarkan berumur 24 jam Dipipet sejumlah 25
μl
Dimasukkan ke dalam botol berisi 25 ml NA cair steril Dituang ke dalam cawan petri steril
Dibiarkan beku dan dibuat 6 lubangsumur 1
2 3
5 4
6
Keterangan : 1 = dimasukkan 50 μl antibiotik
2 = dimasukkan 50 μl antibiotik
3 = dimasukkan 50 μl DMSO
4 = dimasukkan 50 μl DMSO
5 = dimasukkan 50 μl larutan ekstrak
6 = dimasukkan 50 μl larutan ekstrak
Diinkubasi pada suhu optimum selama 24 jam Diamati dan diukur diameter penghambatan tiap sumur
Gambar 9. Diagram alir uji difusi sumur
51
3. Penentuan nilai MIC Minimum Inhibition Concentration modifikasi metode Bloomfield, 1991
