29
E. PENGUJIAN AKTIVITAS ANTIMIKROBA
Pengujian aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan metode in vitro
ataupun dengan metode aplikasi Davidson dan Parish, 1989. Metode aplikasi adalah metode dimana senyawa antimikroba
diaplikasikan secara langsung terhadap produk pangan untuk mengukur pengaruhnya terhadap mikroflora alami produk pangan tersebut. Metode
in vitro adalah uji aktivitas antimikroba dengan senyawa antimikroba
yang tidak diaplikasikan langsung kepada produk. Metode ini hanya bisa memberikan informasi awal tentang potensi kegunaan komponen
sebagai antimikroba. Davidson dan Parish, 1993. Salah satu metode pengujian aktivitas antimikroba secara in vitro adalah uji difusi sumur
dan penentuan nilai MIC.
1. Uji difusi sumur
Uji difusi sumur adalah cara menguji aktivitas antimikroba yang paling banyak digunakan NCCLS, 1991. Branen 1993
menyatakan bahwa uji difusi sumur merupakan cara yang sederhana dan cepat, walaupun cara ini memiliki kelemahan pada data yang
dihasilkan karena lebih bersifat kualitatif. Aktivitas antimikroba yang terlihat pada uji difusi sumur dipengaruhi oleh beberapa faktor,
antara lain: 1 tipe dan ukuran cawan, 2 tipe agar, pH, dan kandungan garamnya, 3 kemampuan zat untuk berdifusi kedalam
agar, 4 karakteristik media, dan 5 jenis bakteri uji yang digunakan.
Ekstrak yang dimasukkan ke dalam sumur atau lubang akan berdifusi masuk kedalam agar selama masa inkubasi. Bila memiliki
sifat antimikroba, ekstrak ini akan menimbulkan gradien konsentrasi di dalam agar dan membentuk penghambatan yang akan terlihat
sebagai zona bening. Semakin jauh jarak masuk ke dalam agar, maka konsentrasi ekstrak yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji
juga akan semakin berkurang. Berkurangnya konsentrasi berarti
30 kekuatan ekstrak berkurang dan hanya beberapa bakteri yang dapat
terhambat. Hal inilah yang menimbulkan gradien konsentrasi pada tingkat-tingkat konsentrasi tertentu Davidson dan Parish, 1993.
Batas dari zona bening adalah pada saat kekuatan ekstrak sudah jauh berkurang, sehingga tidak lagi menghambat pertumbuhan
bakteri uji. Zona bening yang terbentuk disebut juga diameter penghambatan. Diameter penghambatan yang terbentuk dipengaruhi
oleh beberapa faktor, antara lain konsentrasi ekstrak, tingkat kelarutan ekstrak, dan kemampuan ekstrak untuk berdifusi kedalam
agar Prescott et al., 2003.
2. Penggunaan
Kontrol
Pada uji difusi sumur digunakan kontrol sebagai pembanding. Kontrol negatif yang digunakan adalah pelarut untuk melarutkan
ekstrak, yaitu Dimetilsulfoksida DMSO, sedangkan kontrol positif yang digunakan adalah antibiotik. Tujuan menggunakan kontrol
negatif adalah untuk melihat pengaruh DMSO terhadap aktivitas antimikroba ekstrak. Kontrol positif digunakan sebagai pembanding
terhadap aktivitas antimikroba ekstrak, karena antibiotik merupakan senyawa antimikroba yang telah dibuat secara terstandar.
a. Kontrol positif
Kontrol positif yang digunakan adalah antibiotik dengan spektrum antimikroba yang luas, yaitu amoxycillin. Antibiotik
adalah produk metabolit yang dihasilkan organisme tertentu, yang dalam jumlah amat kecil bersifat merusak atau menghambat
mikroorganisme lainnya. Antibiotik merupakan zat kimia yang dihasilkan oleh suatu mikroba dan bersifat menghambat
mikroorganisme yang lain. Antibiotik merupakan bahan yang sering digunakan dalam
penelitian. Beberapa antibiotik yang sering digunakan pada
31 penelitian adalah penicillin, actinomycins, chloramphenicol,
cycloserine , asam nalidiksik dan novobiosin, rifampin,
cycloheximide , daunomisin, mitomisin C, dan polioksin Prescott
et al., 2003. Suatu zat antibiotik hendaknya memiliki sifat sebagai
berikut: 1 mampu menghambat atau merusak patogen spesifik, 2 tidak mengakibatkan berkembangnya bentuk-bentuk resisten,
3 tidak menimbulkan efek samping yang dikehendaki, 4 tidak mengganggu flora alamiah dari suatu benda atau manusia, 5
harus dapat dimasukkan dari mulut tanpa diinaktifkan, dan 6 sangat mudah larut dalam air.
Amoxycillin adalah senyawa antibiotik semisintesis dari
Penisilin. Penisilin merupakan salah satu antibiotik yang umum dan banyak beredar di masyarakat. Penisilin merupakan
antibiotik modern yang pertama, dan merupakan antibiotik yang bermanfaat karena paling luas penggunaannya. Penisilin
ditemukan sebagai metabolit sekunder dari kapang jenis tertentu, yaitu Penicillium notatum, dan P. Chrysogenum.
Cara kerja penisilin menghambat pertumbuhan bakteri adalah dengan menghambat pembentukan dinding sel bakteri.
Penisilin menghambat kerja enzim yang mengkatalis reaksi pemindahan peptida-peptida dalam proses pembentukan
peptidoglikan dinding sel. Kemampuan ini dimiliki penisilin karena kemiripan struktur dengan enzim pengkatalis. Penisilin
diketahui efektif karena memiliki kemampuan menghambat sintesis peptidoglikan dinding sel bakteri. Penghambatan tersebut
bersifat spesifik dan sedikit sekali mempunyai efek buruk bagi pemakai Prescott et al., 2003.
Penisilin menghambat bakteri patogen hanya bila bakteri tersebut sedang berada pada fase log Prescott et al., 2003. Hal
ini sesuai dengan kemampuan penisilin menghambat sintesis peptidoglikan dinding sel yang terjadi pada fase log. Penisilin
32 menghalangi pembentukan ikatan peptidoglikan dengan
sempurna dan pada akhirnya dapat mengakibatkan osmotik lisis Prescott et al., 2003. Bila sel bakteri yang peka terhadap
penisilin ditumbuhkan dengan tambahan antibiotik ini, sel bakteri tersebut akan menjadi luar biasa besar ukurannya serta memiliki
bentuk yang tidak umum lalu kemudian lisis. Saat ini telah diketahui beberapa mekanisme penghambatan
penisilin yang lain. Pensilin diketahui dapat berikatan dengan protein pengikat dan dapat menghancurkan bakteri dengan
mengaktifkan enzim autolisis. Penisilin menstimulasi protein khusus yang disebut hollins untuk membentuk lubang pada
membran plasma. Hal ini akan mengakibatkan membran rusak dan menyebabkan kematian. Beberapa antibiotik lain yang
memiliki mekanisme serupa dengan penisilin adalah cephalosporins
, vancomycin, dan bakitrasin Prescott et al.,, 2003.
Penisilin G efektif terhadap beberapa bakteri patogen Gram positif, misalnya Streptococcus dan Staphylococcus. Ampisilin,
yang merupakan salah satu turunan penisilin, diketahui efektif untuk dikonsumsi dengan diminum, dan memiliki spektrum
penghambatan bakteri yang lebih luas antara lain dapat menghambat bakteri Gram negatif, seperti Haemophilus,
Salmonella , dan Shigella.
b. Kontrol negatif
Kontrol negatif yang digunakan pada uji difusi sumur adalah DMSO dimetil sulfoksida. DMSO adalah pelarut yang
umum digunakan dalam analisis atau percobaan, karena kemampuannya untuk melarutkan senyawa baik polar ataupun
non polar. DMSO memiliki sifat seperti emulsifier. Rumus senyawa DMSO adalah CH
3 2
SO. Gambar strukturnya dapat dilihat pada Gambar 4.
33 Gambar 4. Dimethyl sulfoxide atau DMSO Anonim
d
, 2006 DMSO merupakan cairan bening dengan bau seperti
bawang putih. DMSO memiliki titik didih 189°C dan dapat larut dalam air. DMSO bersifat stabil dalam kondisi normal dan
bersifat higrokopis. DMSO efektif sebagai pelarut dalam proses ekstraksi dan pemisahan komponen aroma flavor, serta dalam
fraksinasi komponen tidak jenuh dari suatu bahan Anonim
d
, 2006.
3. Penentuan Nilai MIC
MIC Minnimum Inhibitory Concentration adalah konsentrasi terendah dari suatu senyawa antimikroba dimana antimikroba tersebut
masih memiliki kemampuan menghambat mikroba dalam periode inkubasi tertentu Davidson dan Parish, 1993. Nilai MIC penting
diketahui untuk mengkonfirmasi resistensi bakteri uji terhadap senyawa antimikroba dan untuk menentukan aktivitas senyawa antimikroba baru
Anonim
c
, 2006. Penentuan MIC dapat dilakukan dengan cara padat ataupun cara
cair. Perbedaan cara padat dan cara cair terletak pada jenis media agar yang digunakan untuk analisis. Pada cara cair, mikroba uji yang telah
ditumbuhkan didalam media cair kemudian ditambahkan senyawa antimikroba dalam selang konsentrasi tertentu Davidson dan Parish,
1993. Cara ini disebut metode kontak. Nilai MIC ditentukan pada konsentrasi dimana mikroba didalam media cair sudah tidak tumbuh
lagi, dengan ciri-ciri media agar cair bening tidak keruh Davidson dan Parish, 1993. Pada cara padat digunakan uji difusi sumur. Data diameter
penghambatan kemudian diolah dengan regresi sehingga didapat persamaan sederhana yang dapat digunakan untuk mencari nilai MIC.
34 Kelebihan dari metode kontak adalah hasilnya yang lebih akurat.
Kelemahannya adalah waktu yang dibutuhkan lebih lama, diperlukan ketelitian dan pengulangan analisis berkali-kali untuk mendapatkan data
yang valid. Kelebihan dari metode difusi sumur untuk menentukan nilai MIC adalah cara ini lebih sederhana dan waktu yang diperlukan lebih
singkat, sedangkan kelemahannya adalah datanya kurang akurat. Beberapa nilai MIC dari minyak rempah-rempah terhadap beberapa
bakteri dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Nilai MIC Minnimum Inhibitory Concentration beberapa
minyak rempah-rempah vv Hammer, et al., 1999a
Rempah-rempah Ent
eroco cc
us faecalis
E. col i
Pseudomonas aeru
gino sa
S a
lmonel la
Th ypiimuri
u m
S. aureus Candida
albicans
Basil 2.0 0.5 2.0 2.0 2.0 0.5
Jinten hitam 1.0
2.0 2.0
2.0 2.0
2.0 Cengkeh 0.5
0.25 2.0
2.0 0.25
0.12 Jahe
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 Oregano
0.25 0.12 2.0 0.12 0.12
0.12 Tanaman
lemon 0.12 0.06 1.0 0.25 0.06
0.06 Tanaman teh
2.0 0.25
2.0 0.5
0.5 0.5
Thyme 0.5 0.12 2.0 2.0
0.25 0.12
Peppermint 2.0 0.5 2.0 1.0 1.0 0.5
F. UJI FITOKIMIA
Fitokimia mempelajari aneka ragam senyawa organik yang dibentuk dan ditimbun oleh tumbuhan, yaitu mencakup struktur kimia,
biosintesis, perubahan serta metabolisme, penyebaran secara alamiah, dan fungsi biologis. Kandungan kimia tumbuhan dapat digolongkan
Kategori