Penentuan nilai MIC Minimum Inhibition Concentration modifikasi metode Bloomfield, 1991

51

3. Penentuan nilai MIC Minimum Inhibition Concentration modifikasi metode Bloomfield, 1991

Nilai MIC ditentukan dengan cara padat menggunakan metode Bloomfield 1991, yaitu dengan memplotkan antara ln konsentrasi ekstrak pada sumbu X terhadap nilai kuadrat zona penghambatan pada sumbu Y. Perpotongan dari regresi linier Y = a + bX dengan sumbu X sebagai nilai Mt. Nilai MIC adalah 0.25 x Mt. Konsentrasi ekstrak yang dibuat untuk penentuan nilai MIC adalah 10, 20, 30, 40, dan 50 ww yang kemudian dimasukkan ke dalam 5 botol bening kecil. Ekstrak yang digunakan adalah ekstrak-ekstrak terbaik pada uji difusi sumur. Kultur yang akan digunakan untuk uji difusi sumur disegarkan terlebih dahulu dengan cara diambil satu ose, lalu ditumbuhkan pada media pertumbuhan NB 10 ml dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah diinkubasi diambil kembali 1 ml dan dipindahkan kedalam NB 9 ml untuk kemudian diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama. Dari kultur yang telah disegarkan dan berumur 24 jam diambil sebanyak yang diperlukan, sesuai dengan hasil perhitungan pada tahapan persiapan kultur sebelumnya nilai A, dan dimasukkan kedalam media agar 25 ml yang kemudian dituang kedalam cawan petri steril. Agar kemudian dibiarkan membeku. Setelah beku, dibuat lubangsumur menggunakan alat pembuat sumur. Pengujian dilakukan duplo. Cawan uji difusi sumur kemudian disimpan didalam refrigerator selama satu jam, lalu diinkubasi tidak terbalik pada suhu 37°C selama 24 jam. Diagram alir uji difusi sumur dapat dilihat pada Gambar 10. Setelah itu, dilakukan pengamatan jumlah bakteri menggunakan metode hitungan cawan dan dihitung nilai MIC. 52 Kultur mikroba yang telah disegarkan berumur 24 jam Di-vorteks Dipipet sejumlah 25 μl Dimasukkan ke dalam botol berisi 25 ml NA cair steril Dituang ke dalam cawan petri steril Dibiarkan beku Dibuat 6 lubangsumur Dibuat 4 lubangsumur 1 1 2 5 6 3 2 3 4 4 Ket: 1 = dimasukkan 50 μl ekstrak 1030 Ket:1=dimasukkan 50 μl ekstrak 50 2 = dimasukkan 50 μl ekstrak 1030 2= dimasukkan 50 μl ekstrak 50 3 = dimasukkan 50 μl ekstrak 2040 3= dimasukkan 50 μl DMSO 4 = dimasukkan 50 μl ekstrak 2040 4= dimasukkan 50 μl DMSO 5 = dimasukkan 50 μl DMSO 6 = dimasukkan 50 μl DMSO Diinkubasi pada suhu optimum selama 24 jam Diamati dan diukur diameter penghambatan tiap sumur Gambar 10. Diagram alir penentuan nilai MIC

4. Uji fitokimia