TEMPAT DAN WAKTU Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Pusat PENGOLAHAN DATA

40

III. BAHAN DAN METODE A. BAHAN DAN ALAT

Bahan baku utama pada penelitian ini adalah bubuk kulit kayu mesoyi. Bubuk kulit kayu mesoyi yang digunakan didapat dari pasar Tanah Abang, Jakarta Pusat. Untuk proses ekstraksi digunakan aquades, heksan teknis, etil asetat teknis, metanol teknis, etanol teknis, es batu, dan gas N 2 . Bahan-bahan yang digunakan untuk persiapan kultur, uji difusi sumur dan penentuan MIC Minimum Inhibition Concentration adalah spiritus, antibiotik, alkohol 70, NaCl, Dimetil Sulfoksida DMSO, dan Nutrient Broth NB serta Nutrient Agar NA. Kultur murni bakteri uji yang digunakan terdiri dari bakteri patogen yaitu Staphylococcus aureus, Eschericia coli, Salmonella Typhimurium, dan Bacillus cereus , sedangkan kultur bakteri uji yang merupakan bakteri pembusuk yaitu Pseudomonas aeruginosa. Peralatan yang digunakan pada proses ekstraksi adalah peralatan refluks, oven vakum, kertas saring Whatman No.1, termometer, sudip, gelas ukur 100 ml, botol berwarna gelap, corong kaca, botol kaca bening, rotavapor, labu refluks, tabung rotavapor, plastik, kain, dan alat saring vakum. Alat-alat untuk persiapan kultur, uji difusi agar dan penentuan nilai MIC adalah otoklaf, shaker, gelas piala, sudip, timbangan, sudip, peralatan gelas, plastik tahan panas, cawan petri, ose, pipet mikron ukuran 1000 μl dan 200 μl, tip untuk pipet mikro, alat pembuat sumur, botol kaca, tusuk gigi, jar atau botol kaca, gelas piala, cawan petri, jangka sorong, bunsen bakar, baskom, tissue, label, pembungkus aluminium, dan gunting.

B. TEMPAT DAN WAKTU Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan, Pusat

Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor, dan Laboratorium Kimia Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari Februari 2006 hingga September 2006. 41

C. METODE PENELITIAN

Penelitian dibagi menjadi penelitian pendahuluan dan penelitian lanjutan. Penelitian pendahuluan terdiri dari beberapa tahap, yaitu : 1 persiapan kultur bakteri uji, 2 proses ekstraksi, dan 3 pengujian aktivitas antimikroba dengan uji difusi sumur. Penelitian kemudian dilanjutkan dengan beberapa tahap, yaitu : 1 penentuan MIC dan 2 uji fitokimia Gambar 5. Bubuk kayu kulit kayu mesoyi Jenis ekstrak terpilih Gambar 5. Diagram alir penelitian Ekstraksi tunggal air, etanol, minyak atsiri Ekstraksi bertingkat heksan, etil asetat, metanol Ekstraksi Persiapan kultur bakteri uji Uji aktivitas antimikroba Penentuan nilai MIC Uji fitokimia Ekstrak 42

1. Penelitian Pendahuluan

a. Persiapan kultur bakteri uji

Pada tahap persiapan kultur bakteri uji dilakukan perhitungan total mikroba menggunakan metode hitungan cawan. Persiapan kultur ini perlu dilakukan untuk mengetahui jumlah total mikroba sehingga dapat dihitung pengenceran yang diperlukan agar saat kultur digunakan pada uji difusi sumur total mikroba pada cawan adalah 1x10 5 hingga 1x10 6 dan jumlah ini stabil di setiap cawan. Kultur murni yang berupa padatan diambil satu ose, kemudian dilarutkan secara aseptis dalam media pertumbuhan NB 10 ml. Media NB yang telah berisi mikroba kemudian diinkubasi pada suhu ruang 37°C selama 24 jam. Setelah itu, dari NB 10 ml diambil 1 ml dan dimasukkan kedalam NB 9 ml, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Bila pada NB 9 ml cairannya berwarna keruh maka diambil 1 ml dari NB 9 ml dan diencerkan pada pengencer larutan fisiologis 0.85 sampai pengenceran ke-8. Pada pengenceran ke-5 sampai dengan ke-8, diambil 1 ml dan dimasukkan kedalam cawan petri steril. Kemudian diberi media pertumbuhan agar dengan metode tuang pour plate. Cawan kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Bila pada NB 9 ml cairannya berwarna bening maka diambil 1 ml dari NB 9 ml dan diencerkan pada larutan pengencer larutan fisiologis 0.85 sampai pengenceran ke-5. Pada pengenceran ke-0 sampai dengan ke-5, diambil 1 ml dan dimasukkan kedalam cawan petri steril. Kemudian diberi media pertumbuhan agar dengan metode tuang pour plate . Cawan kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Diagram alir persiapan kultur menggunakan metode hitungan cawan dapat dilihat pada Gambar 6. Setelah dilakukan tahapan persiapan kultur dan telah didapat jumlah total mikroba, maka selanjutnya dihitung pengenceran yang diperlukan saat mengerjakan uji difusi sumur. 43 Kultur Bakteri Diambil satu ose Dimasukkan ke dalam 10 ml NB steril Diinkubasi 24 jam pada suhu 37 ºC Diambil 1 ml Dimasukkan ke dalam 9 ml NB steril Diinkubasi 24 jam pada suhu 37 ºC Diamati kekeruhannya Keruh Agak bening Dipipetl 1 ml Dipipet 1 ml Dimasukkan ke dalam Dimasukkan ke dalam 9 ml pengencer steril 9 ml pengencer steril Dilakukan pengenceran dari 10 1 -10 8 Dilakukan pengenceran dari 10 -10 5 Dipipet masing-masing 1ml Dipipet masing-masing 1 ml dari pengenceran 10 5 -10 8 dari pengenceran 10 -10 5 Masing-masing dimasukkan Masing-masing dimasukkan ke dalam cawan petri steril ke dalam cawan petri steril Kedalam cawan petri dituang agar Didiamkan hingga agar membeku Diinkubasi 48 jam pada 37 ºC Diamati dan dihitung total mikroba Ditentukan jumlah µl NB yang akan dimasukkan ke dalam 25 ml NA cair A Gambar 6. Diagram alir metode hitungan cawan 44

b. Proses ekstraksi

Ekstraksi tunggal dilakukan dengan mengekstrak secara langsung bubuk kulit kayu mesoyi. Tujuan dari ekstraksi tunggal adalah mendapatkan ekstrak kulit kayu mesoyi yang dekat dengan aplikasi sehari-hari, dengan menggunakan pelarut yang aman dan mudah didapat air dan etanol teknis. Selain itu, penyulingan minyak atsiri juga merupakan ekstraksi tunggal. Minyak atsiri diperoleh dengan teknik destilasi uap, sedangkan ekstrak etanol dan air diperoleh dengan teknik ekstraksi refluks. Pada ekstraksi tunggal bubuk kulit kayu mesoyi dilakukan ekstraksi langsung dengan etanol teknis dan juga aquades sebagai pelarut. Perbandingan antara pelarut dengan bahan adalah 3:1 vw. Suhu refluks harus dibawah titik didih pelarut yang digunakan. Karenanya ekstraksi dengan pelarut etanol teknis berlangsung pada suhu 60°C, sedangkan ekstraksi dengan aquades berlangsung pada suhu 100°C. Proses ekstraksi bahan secara refluks dicoba selama 5 jam secara langsung dan 5 jam dengan pengulangan ekstraksi. Ekstraksi bahan selama 5 jam dengan pengulangan dilakukan dengan mengekstraksi bahan selama 3 jam yang kemudian diekstraksi kembali selama 2 jam. Ekstrak hasil refluks selama 5 jam secara langsung ternyata memiliki karakteristik yang lebih tidak baik dibandingkan dengan ekstrak hasil proses refluks selama 3 jam yang kemudian direfluks kembali selama 2 jam. Karakteristik yang tidak baik tersebut antara lain tidak adanya bau khas mesoyi dan rendemen yang lebih sedikit. Karenanya untuk selanjutnya, baik pada ekstraksi tunggal ataupun ekstraksi bertingkat, ekstraksi refluks dilakukan selama 3 jam dan cairan disaring dengan kertas saring Whatman No.1 kemudian diekstraksi kembali selama 2 jam dengan menambahkan pelarut dengan jumlah yang sama. Cairan ekstrak yang didapat kemudian disaring dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan penyaring vakum. Proses ekstraksi 45 tunggal ini menghasilkan ekstrak air dan ekstrak etanol. Diagram alir proses ekstraksi tunggal menggunakan etanol dan air dapat dilihat pada Gambar 7. Dipekatkan dengan rotavapor pada suhu 40 o C Dipekatkan dengan rotavapor pada suhu 50 o C Dihembuskan gas N 2 Gambar 7. Skema ekstraksi tunggal dengan pelarut etanol dan air Kulit kayu mesoyi didestilasi uap untuk mendapatkan minyak atsiri. Dari minyak atsiri diperoleh komponen volatil kulit kayu mesoyi. Ampas kulit kayu mesoyi hasil penyulingan uap minyak atsiri tentu masih mengandung komponen-komponen yang bersifat non-volatil, karena itulah diekstraksi lanjut secara bertingkat menggunakan pelarut organik dengan rasio antara pelarut dan bahan adalah 3:1 vw. Tujuan Direfluks dengan etanol 60 o C, 3 jam Direfluks dengan air 100 o C, 3 jam Ampas Filtrat Bubuk Kulit Kayu Mesoyi Ampas Filtrat Ulangan 60°C, 2 jam Ekstrak etanol Ekstrak air Ulangan 60°C, 3 jam 46 ekstraksi bertingkat adalah fraksinasi dan mengisolasi komponen aktif. Setelah dikeringkan dengan oven vakum selama 24 jam pada suhu kamar 35-40°C, ampas kulit kayu mesoyi kemudian diekstraksi dengan pelarut heksan. Setelah heksan yang merupakan pelarut non polar kemudian dilanjutkan proses ekstraksi secara bertingkat dengan pelarut yang lebih tinggi kepolarannya, yaitu etil asetat semi polar dan metanol polar. Suhu yang digunakan pada proses ekstraksi bertingkat adalah 60°C. Pada ekstraksi bertingkat dilakukan proses pengulangan refluks selama 3 jam kemudian diekstraksi kembali dengan pelarut yang sama selama 2 jam. Cairan ekstrak yang didapat disaring dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan penyaring vakum. Setiap penggantian pelarut ampas dikeringkan dengan oven vakum selama 24 jam pada suhu kamar 35-40°C. Diagram alir ekstraksi bertingkat dapat dilihat pada Gambar 8. Pada proses ekstraksi bertingkat ini diperoleh ekstrak heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol. Jenis-jenis ekstrak kulit kayu mesoyi yang didapat, kecuali minyak atsiri, kemudian dipekatkan menggunakan rotavapor. Ekstrak air dirotavapor pada suhu 50 o C, sedang ekstrak etanol, ekstrak heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol dirotavapor pada suhu 40°C. Suhu ini dipilih sehingga diharapkan senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak tidak akan rusak. Ekstrak kemudian dihembus dengan gas N 2 sebelum disimpan. Penghembusan ekstrak dengan gas N 2 dilakukan terhadap seluruh ekstrak etanol, ekstrak heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol. Botol ekstrak yang telah seluruhnya diganti kandungan udaranya dari O 2 menjadi N 2 akan menjadi dingin. Selain itu, ciri-ciri lainnya adalah berat ekstrak yang terus berkurang, yang berarti pelarut telah dihilangkan oleh hembusan N 2 . Penghembusan gas N 2 dihentikan bila botol ekstrak tidak menjadi lebih lebih dingin lagi dan berat ekstrak sudah stabil. Berat ekstrak yang stabil adalah bila berat sudah tidak berubah, atau paling tidak perubahannya tidak lebih dari 0,1 gr. 47 Ulangan 60 ºC, 2 jam Ulangan 60 ºC, 2 jam Ulangan 60 ºC, 2 jam Khusus untuk ekstrak air kulit kayu mesoyi dilakukan analisis kadar air ekstrak, karena air tidak dapat dihilangkan secara sempurna oleh rotavapor. Pengukuran kadar air ekstrak air kulit kayu mesoyi dilakukan dengan metode azeotropik. Direfluks dengan heksan 60 o C, 3 jam ` Direfluks dengan etil asetat 60 o C, 3 jam Dipekatkan 40 o C Dihembus gas N 2 Direfluks dengan metanol Dipekatkan 40 o C 60 o C, 3 jam Dihembus gas N 2 Dipekatkan 40°C Dihembus gas N 2 Gambar 8. Diagram alir proses ekstraksi bertingkat dari ampas kulit kayu mesoyi c. Uji Difusi Sumur Pengujian aktivitas antimikroba awal ekstrak-ekstrak kulit kayu mesoyi dilakukan dengan uji difusi sumur. Uji difusi sumur merupakan Ampas Filtrat Ampas Filtrat Ampas Filtrat Ekstrak metanol Ampas hasil destilasi uap Ekstrak heksan Ekstrak etil asetat 48 uji kualitatif. Pada uji difusi sumur diukur diameter penghambatan. Hasilnya kemudian digunakan untuk memilih ekstrak yang akan diuji lebih lanjut. Hasil uji difusi sumur diolah secara statistik. Uji lebih lanjut yang dilakukan adalah penentuan nilai MIC dan uji fitokimia. Sesuai dengan hasil perhitungan total mikroba pada tahap persiapan kultur bakteri uji, maka untuk mendapatkan total mikroba yang seragam didalam cawan uji difusi agar sebanyak 1x10 5 , maka kultur harus diencerkan sebanyak 10 -3 . Cara untuk mengencerkan sebanyak 10 -3 kali adalah dengan memasukkan 25 μl bakteri uji kedalam 25 ml agar.

2. Penelitian Lanjutan

Penelitian lanjutan bertujuan untuk mengetahui nilai MIC dan komponen fitokimia yang dimiliki ekstrak kulit kayu mesoyi terpilih. Ekstrak terpilih adalah ekstrak yang dapat menghambat semua bakteri uji. Ekstrak-ekstrak terpilih didasarkan pada hasil uji difusi sumur secara kualitatif yang diolah secara statistik. Ekstrak terpilih adalah minyak atsiri dan ekstrak etanol. Penentuan nilai MIC dilakukan terhadap satu jenis mikroba yang pada uji difusi sumur sebelumnya dapat dihambat paling optimum oleh ekstrak terpilih. Analisis fitokimia yang dilakukan terhadap kedua ekstrak terpilih adalah analisis secara kualitatif fenol, tanin, saponin, terpenoid, steroid, flavonoid, dan alkaloid.

D. METODE ANALISIS

Pengujian aktivitas antimikroba ekstrak-ekstrak kayu dilakukan dengan beberapa metode analisis, antara lain: 1 uji difusi sumur, 2 penentuan MIC Minimum Inhibition Concentration, dan 3 uji fitokimia.

1. Perhitungan nilai rendemen

Sejumlah bubuk kulit kayu mesoyi sekitar 30 g dimasukkan kedalam tabung refluks dan diekstraksi selama 3 jam kemudian 49 dilanjutkan selama 2 jam. Cairan ekstrak yang didapat kemudian dirotavapor dan dihembus gas N 2 untuk menghilangkan pelarut. Setelah didapat ekstrak tanpa pelarut kemudian dapat dihitung rendemennya dengan rumus berikut ini. dimana: W = berat ekstrak g W = berat bahan yang diekstrak g Ukuran sampel bubuk kulit kayu mesoyi = 40 mesh

2. Uji difusi sumur metode modifikasi Garriga et al., 1993

Pengujian aktivitas antimikroba dilakukan dengan uji difusi sumur. Uji difusi sumur dilakukan 3 kali ulangan dari ekstrak-ekstrak kulit kayu mesoyi yang sama. Ekstrak-ekstrak kulit kayu mesoyi dilarutkan dalam DMSO dan diuji efektivitasnya terhadap lima mikroba dari jenis bakteri patogen dan bakteri perusak pangan dengan jumlah total mikroba dalam cawan adalah 1x10 5 hingga 1x10 6 koloniml. Total mikroba dikonfirmasi dengan metode hitungan cawan. DMSO digunakan sebagai kontrol negatif untuk menghilangkan pengaruh DMSO terhadap mikroba uji. Selain kontrol negatif, digunakan juga antibiotik amoxycillin sebagai kontrol positif. Antibiotik dilarutkan dalam DMSO pada konsentrasi 0,01. Kultur yang akan digunakan untuk uji difusi sumur disegarkan terlebih dahulu dengan cara diambil satu ose, lalu ditumbuhkan pada media pertumbuhan NB 10 ml dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah diinkubasi diambil kembali 1 ml dan dipindahkan kedalam NB 9 ml untuk kemudian diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama. Dari kultur yang telah disegarkan dan berumur 24 jam diambil sebanyak yang diperlukan, sesuai dengan hasil perhitungan pada tahapan persiapan kultur sebelumnya nilai A, dan dimasukkan kedalam media agar 25 ml yang kemudian dituang kedalam cawan petri steril. Rendemen = WW × 100 ww 50 Agar kemudian dibiarkan membeku. Setelah beku, dibuat lubangsumur menggunakan alat pembuat sumur. Pengujian dilakukan duplo, karenanya pada setiap satu cawan dibuat 6 lubangsumur. Dua lubangsumur diisi dengan ekstrak kulit kayu mesoyi, dua lubangsumur lainnya diisi dengan kontrol positif, dan 2 lubangsumur sisanya diisi dengan kontrol negatif. Cawan uji difusi sumur kemudian disimpan didalam refrigerator selama 30 menit, lalu diinkubasi tidak terbalik pada suhu 37°C selama 24 jam. Diagram alir uji difusi sumur dapat dilihat pada Gambar 9. Kultur mikroba yang telah disegarkan berumur 24 jam Dipipet sejumlah 25 μl Dimasukkan ke dalam botol berisi 25 ml NA cair steril Dituang ke dalam cawan petri steril Dibiarkan beku dan dibuat 6 lubangsumur 1 2 3 5 4 6 Keterangan : 1 = dimasukkan 50 μl antibiotik 2 = dimasukkan 50 μl antibiotik 3 = dimasukkan 50 μl DMSO 4 = dimasukkan 50 μl DMSO 5 = dimasukkan 50 μl larutan ekstrak 6 = dimasukkan 50 μl larutan ekstrak Diinkubasi pada suhu optimum selama 24 jam Diamati dan diukur diameter penghambatan tiap sumur Gambar 9. Diagram alir uji difusi sumur 51

3. Penentuan nilai MIC Minimum Inhibition Concentration modifikasi metode Bloomfield, 1991

Nilai MIC ditentukan dengan cara padat menggunakan metode Bloomfield 1991, yaitu dengan memplotkan antara ln konsentrasi ekstrak pada sumbu X terhadap nilai kuadrat zona penghambatan pada sumbu Y. Perpotongan dari regresi linier Y = a + bX dengan sumbu X sebagai nilai Mt. Nilai MIC adalah 0.25 x Mt. Konsentrasi ekstrak yang dibuat untuk penentuan nilai MIC adalah 10, 20, 30, 40, dan 50 ww yang kemudian dimasukkan ke dalam 5 botol bening kecil. Ekstrak yang digunakan adalah ekstrak-ekstrak terbaik pada uji difusi sumur. Kultur yang akan digunakan untuk uji difusi sumur disegarkan terlebih dahulu dengan cara diambil satu ose, lalu ditumbuhkan pada media pertumbuhan NB 10 ml dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Setelah diinkubasi diambil kembali 1 ml dan dipindahkan kedalam NB 9 ml untuk kemudian diinkubasi pada suhu dan waktu yang sama. Dari kultur yang telah disegarkan dan berumur 24 jam diambil sebanyak yang diperlukan, sesuai dengan hasil perhitungan pada tahapan persiapan kultur sebelumnya nilai A, dan dimasukkan kedalam media agar 25 ml yang kemudian dituang kedalam cawan petri steril. Agar kemudian dibiarkan membeku. Setelah beku, dibuat lubangsumur menggunakan alat pembuat sumur. Pengujian dilakukan duplo. Cawan uji difusi sumur kemudian disimpan didalam refrigerator selama satu jam, lalu diinkubasi tidak terbalik pada suhu 37°C selama 24 jam. Diagram alir uji difusi sumur dapat dilihat pada Gambar 10. Setelah itu, dilakukan pengamatan jumlah bakteri menggunakan metode hitungan cawan dan dihitung nilai MIC. 52 Kultur mikroba yang telah disegarkan berumur 24 jam Di-vorteks Dipipet sejumlah 25 μl Dimasukkan ke dalam botol berisi 25 ml NA cair steril Dituang ke dalam cawan petri steril Dibiarkan beku Dibuat 6 lubangsumur Dibuat 4 lubangsumur 1 1 2 5 6 3 2 3 4 4 Ket: 1 = dimasukkan 50 μl ekstrak 1030 Ket:1=dimasukkan 50 μl ekstrak 50 2 = dimasukkan 50 μl ekstrak 1030 2= dimasukkan 50 μl ekstrak 50 3 = dimasukkan 50 μl ekstrak 2040 3= dimasukkan 50 μl DMSO 4 = dimasukkan 50 μl ekstrak 2040 4= dimasukkan 50 μl DMSO 5 = dimasukkan 50 μl DMSO 6 = dimasukkan 50 μl DMSO Diinkubasi pada suhu optimum selama 24 jam Diamati dan diukur diameter penghambatan tiap sumur Gambar 10. Diagram alir penentuan nilai MIC

4. Uji fitokimia

Fitokimia saat ini telah menjadi ilmu kimia terapan yang banyak digunakan untuk mengetahui secara kualitatif kandungan kimia tanaman Harborne, 1996. Kandungan kimia tanaman perlu diketahui untuk menduga komponen aktif yang menyebabkan suatu bahan tanaman memiliki aktivitas antimikroba. Uji fitokimia yang dilakukan adalah 53 identifikasi terhadap beberapa jenis metabolit sekunder yang umum terdapat pada tanaman. Identifikasi dilakukan terhadap metabolit sekunder karena metabolit sekunder merupakan kandungan dalam bahan yang biasanya menjadi senyawa aktif yang memiliki sifat antimikroba.

a. Uji golongan fenol dan tanin Houghton dan Raman, 1998

Ekstrak kulit kayu mesoyi sebanyak 1 ml ditambahkan beberapa tetes FeCl 3 . Bila terbentuk warna hitam kehijauan, maka ekstrak berarti mengandung senyawa golongan fenol. Larutan kemudian ditambahkan gelatin. Bila terbentuk gel yang cukup stabil, maka ekstrak berarti mengandung senyawa dari golongan tanin.

b. Uji golongan flavonoid Harborne, 1996

Ekstrak kulit kayu mesoyi sebanyak 1 ml ditambahkan beberapa tetes H 2 SO 4 , lalu dikocok kuat-kuat atau menggunakan vorteks. Bila terbentuk warna kuning, maka berarti ekstrak mengandung senyawa golongan flavon dan flavonol. Bila yang terbentuk adalah warna jingga atau krem, maka berarti ekstrak mengandung senyawa golongan flavonoid. Bila yang terbentuk adalah warna krem atau merah tua, maka ekstrak mengandung senyawa golongan khalkon.

c. Uji golongan saponin Harborne, 1996

Ekstrak kulit kayu mesoyi sebanyak 1 ml ditambahkan air panas, kemudian dikocok kuat-kuat atau menggunakan vorteks, selama 10 detik. Bila kemudian terbentuk busa stabil yang tahan hingga lebih dari 10 menit, maka berarti ekstrak mengandung senyawa dari golongan saponin. 54

d. Uji golongan terpenoid dan steroid Harborne, 1996

Ekstrak kulit kayu mesoyi sebanyak 1 ml ditambahkan 2 ml kloroform. Kemudian ditambahkan beberapa tetes asam asetat glasial dan H 2 SO 4 pekat. Larutan kemudian dikocok perlahan. Bila warna larutan berubah menjadi biru atau hijau, maka berarti ekstrak mengandung senyawa dari golongan steroid. Bila warna yang terbentuk adalah merah atau ungu, maka berarti ekstrak mengandung senyawa golongan terpenoid.

e. Uji golongan alkaloid modifikasi Houghton dan Raman, 1998

Ekstrak kulit kayu mesoyi sebanyak 1 ml ditambahkan beberapa tetes NaOH, lalu dikocok kuat-kuat atau divorteks dan disaring dengan kertas saring Whatman No.1. Filtrat kemudian ditambahkan beberapa tetes H 2 SO 4 pekat, lalu divorteks. Lapisan bening yang terbentuk dipermukaan kemudian diambil dan dipindahkan ke tiga tabung reaksi yang lain. Masing-masing kemudian ditambahkan beberapa tetes pereaksi Mayer, Dragendorf, dan Wagner. Bila bereaksi membentuk endapan putih dengan pereaksi Mayer, maka berarti ekstrak mengandung senyawa golongan Alkaloid. Bila dengan pereaksi Dragendorf larutan berubah warna menjadi oranye, maka berarti ekstrak mengandung senyawa golongan alkaloid. Bila terbentuk warna coklat setelah ditambahkan pereaksi Wagner, maka berarti ekstrak mengandung senyawa dari golongan alkaloid.

E. PENGOLAHAN DATA

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan program SPSS 11.0 untuk mengetahui pengaruh aktivitas ekstrak, bakteri uji, dan interaksi diantaranya terhadap nilai diameter penghambatan. Metode yang digunakan adalah General Linear Model GLM dan uji lanjut LSD pada taraf kepercayaan 0.05. Penelitian dilakukan dengan rancangan faktorial. Percobaan 55 faktorial dicirikan oleh perlakuan yang merupakan komposisi dari segala kemungkinan kombinasi dari taraf-taraf dua faktor atau lebih Mattjik dan Sumertajaya, 2000. Model linear dari rancangan ini secara umum adalah sebagai berikut: Y ijk = μ + α i + β j + α β ij + ε ijk dimana : Y ijk = nilai pengamatan pada faktor A ekstrak dan faktor B bakteri μ, α, β = komponen rataan aditif i = taraf faktor A ekstrak kulit kayu mesoyi j = taraf faktor B bakteri uji k= ulangan α β ij = interaksi antara faktor A dan faktor B ε ijk = pengaruh acak sebaran normal 56

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. PERSIAPAN KULTUR BAKTERI UJI

Persiapan kultur bakteri uji dilakukan untuk menentukan jumlah total mikroba dari kultur bakteri uji. Total mikroba penting diketahui agar dapat dihitung pengenceran yang diperlukan, sehingga total mikroba menjadi seragam untuk semua jenis bakteri uji dalam semua cawan, baik untuk uji difusi sumur maupun penentuan MIC, sehingga diameter penghambatan yang terukur dapat langsung dibandingkan secara proporsional. Hasil penghitungan total mikroba dengan metode hitungan cawan dapat dilihat pada Tabel 5. Tabel 5. Total Mikroba Kultur Bakteri Uji Jenis Bakteri Uji Total Mikroba CFUml Staphylococcus aureus 4.7x10 8 Eschericia coli 4.6x10 8 Salmonella Typhimurium 5.4x10 8 Pseudomonas aeruginosa 9.5x10 8 Bacillus cereus 5.4x10 8 Total mikroba yang diharapkan pada semua cawan pada pengujian dengan difusi sumur adalah antara 1x10 5 hingga 1x10 6 . Total mikroba antara 1x10 5 hingga 1x10 6 merupakan total mikroba yang cukup sehat dan tidak terlalu banyak. Inokulum yang mengandung terlalu banyak atau terlalu sedikit bakteri, dapat menyebabkan kesalahan hasil uji Piddock, 1990. Dari hasil perhitungan didapatkan bahwa kelima bakteri uji harus diencerkan sebanyak 10 -3 untuk mendapatkan total mikroba standar dalam cawan, yaitu antara 1x10 5 hingga 1x10 6 .