EMBRYOGENIC CALLUS INDUCTION AND REGENERATION POTENTIAL OF ARABICA COFFEE

32 Gambar 2. Perkembangan pembentukan kalus kopi Arabika pada media induksi dengan perlakuan kombinasi 2,4-D 9.04 µM+ BAP 4.44 µM. A. Empat minggu setelah induksi kalus, dan B. Dua bulan setelah induksi kalus. Gambar 3. Persentase kalus embriogenik kopi Arabika yang terbentuk 2 bulan setelah eksplan dikulturkan pada media induksi kalus. Huruf yang sama di atas grafik tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05. Hasil analisis statistik memperlihatkan bahwa pemberian 2,4-D secara tunggal tanpa dikombinasikan dengan BAP menghasilkan jumlah pro embrio lebih sedikit jika dibandingkan ketika dikombinasikan dengan BAP. Jumlah pro embrio terbanyak dijumpai pada perlakuan kombinasi 2,4-D 9.04 µM+ BAP 4.44 µM. Grafik memperlihatkan terjadinya kenaikan jumlah pro embrio yang dihasilkan sehingga masih dimungkinkan untuk meningkatkan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang digunakan Gambar 5. A A B 33 Gambar 4. Keragaan kalus kopi Arabika. A-B. Kalus embriogenik E dan tidak embriogenik NE Tanda panah. C. Pro embrio kopi Arabika pada media induksi kalus Tanda panah di bawah mikroskop elektron. Gambar 5. Jumlah pro embrio kopi Arabika yang terbentuk pada saat 2 bulan setelah eksplan dikulturkan pada media induksi kalus. Huruf yang sama di atas grafik tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05. Chaudhury dan Qu 2000 menyatakan bahwa auksin dan sitokinin yang diberikan bersama-sama dapat menstimulasi terbentuknya kalus embriogenik, akan tetapi diperlukan rasio tertentu dari kombinasi keduanya untuk menginduksi pembentukan embrio somatik. Hal ini sesuai dengan penelitian sebelumnya yang melaporkan bahwa ketika jaringan eksplan kopi Arabika ditempatkan di media nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin, sel-sel somatik melakukan proses dediferensiasi membentuk kalus dan massa pro embrio Neuenschwander Baumann 1992; Riyadi Tirtoboma 2004; Samson et al. 2006; Mene´ndez-Yuffa´ et al. 2010. Jumlah embrio dalam embriogenesis somatik dapat ditingkatkan, selain memperhatikan keseimbangan zat pengatur tumbuh, perlu mengatur keseimbangan ammonium N dari N tereduksi serta N teroksidasi, mengatur konsentrasi sumber energi, dan asam amino Gray 2005. 1 cm 34 Berdasarkan analisis statistik, bobot kalus perlakuan kombinasi 2,4-D 9.04 µM + BAP 4.44 µM menghasilkan kalus terberat dengan rataan 0.16 g. Gambar 6 memperlihatkan berat kalus bertambah dengan meningkatnya konsntrasi 2,4-D, sementara pemberian 2,4-D tanpa BAP kalus yang terbentuk lebih sedikit. Hal ini terjadi karena tipe morfogenesis pada kultur jaringan sangat tergantung pada rasio antara auksin dan sitokinin yang diberikan. Kalus akan terbentuk jika terdapat rasio auksin terhadap sitokinin yang lebih tinggi. Konsentrasi auksin dan sitokinin yang berbeda mengakibatkan arah pertumbuhan yang berbeda sekalipun rasionya dalam jumlah yang sama George Sherrington 1984; Tores 1989. Kalus dan pro embrio yang terbentuk setelah 2 bulan disubkultur ke media yang sama. Pro embrio yang terbentuk menjadi kalus kembali setelah 1 bulan disubkultur. Warna kalus yang tadinya putih kekuningan berubah menjadi kuning kecokelatan pada 2 bulan setelah disubkultur. Regenerasi Kalus Embriogenik Kopi Arabika Kalus yang terbentuk kemudian di subkultur ke media yang diberi zat pengatur tumbuh kinetin 9.30 µM. Dua bulan di media ini pada perlakuan kombinasi 2,4-D 4.52 µM dan BAP 8.88 µM kalus yang berwarna cokelat kehitaman timbul bintik-bintik putih yang menandakan mulai terbentuknya embrio somatik. Apabila dilihat di bawah mikroskop elektron bintik putih tersebut merupakan kalus yang memasuki fase globular Gambar 7A. Globular yang terbentuk akan berkembang menjadi hati, torpedo Gambar 7B dan kotiledonari. Embrio fase kotiledonari kemudian ditumbuhkan sampai menjadi planlet di media MS tanpa pemberian zat pengatur tumbuh. Hal ini sesuai dengan pernyataan George dan Sherrington 1984 dan Evans et al. 1981 yang menyatakan bahwa awal dari proses embriogenesis somatik dimulai dengan terbentuknya tonjolan membulat, yang biasanya muncul dari eksplan atau kalus. Perkembangan embriogenesis somatik yang normal akan melalui tahapan pro embrio, globular, bentuk hati, torpedo, kotiledonari dan planlet. Gambar 6 . Bobot basah kalus kopi Arabika yang terbentuk pada saat 2 bulan setelah eksplan dikulturkan pada media induksi kalus. Huruf yang sama di atas grafik tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05 35 Gambar 7. Keragaan kecambah kopi Arabika yang terbentuk melalui proses embriogenesis somatik. A Globular tanda panah. B Torpedo. dan C Planlet. Gambar 8. Jumlah kecambah kopi Arabika yang terbentuk pada saat 10 bulan di media regenerasi. Hasil pengamatan terhadap jumlah embrio somatik yang mampu berkecambah hanya berasal dari media kombinasi 2,4-D 4.52 µM dan BAP 8.88 µM dengan persentase 16.67 . Jumlah kecambah yang terbentuk per 0.2 g kalus sebanyak 6 buah Gambar 8. Planlet yang terbentuk terlihat normal dengan hipokotil, daun, dan akar tunggang Gambar 7C. Simpulan Kalus embriogenik berhasil diinduksi dari eksplan daun kopi Arabika. Perlakuan 2,4-D 4.52 µM + BAP 0 µM; 2,4-D 4.52 µM + BAP 4.44 µM; 2,4-D 4.52 µM+ BAP 8.88 µM; dan 2,4-D 9.04 µM + BAP 4.44 µM dapat membentuk kalus kecuali perlakuan kontrol. Berat kalus, persentase kalus embriogenik, dan jumlah pro embrio tertinggi diperoleh pada media kombinasi 2,4-D 8.88 µM dan BAP 4.44 µM. Kalus yang mampu beregenerasi berasal dari media kombinasi 2,4-D 4.52 µM dan BAP 8.88 µM dengan persentase 16.67 dengan jumlah kecambah sebanyak 6 buah per 0.2 g kalus. 36 Daftar Pustaka Albarra´n J, Bertrand B, Lartaud M, Etienne H. 2005. Cycle characteristics in a temporary immersion bioreactor affect regeneration, morphology, water, and mineral status of coffee Coffea arabica somatic embryos. Plant Cell Tissue Organ Culture 81: 27 –36. Andrés M, Gatica-Arias AM, Arrieta-Espinoza G, Esquivel AME. 2008. Plant regeneration via indirect somatic embryogenesis and optimisation of genetic transformation in Coffea arabica L. cvs. Caturra and Catuaí. Pontificia Universidad Católica de Valparaíso –Chile. 111: 1-9. Arimarsetiowati R. 2011. Pengaruh Auksin 2,4-D dan Sitokinin 2-iP Terhadap Pembentukan Embriogenesis Somatik Langsung Pada Eksplan Daun Coffea arabica L. Pelita Perkebunan. 272 : 68-77. Carneiro M F. 1999. Advences in coffee biotechnology. AgBiotechnet 1: 1-7. Chaudhury A, Qu. R. 2000. Somatic embryogenesis and plant regeneration of turf type nermudagrass: Effect of 6-benzyladenine in calli induction medium. Plant Cell Tissue organ. Cult. 60: 113-120. Etienne H, Anthony F, Dussert S, Fernandez D, Lashermes P, Bertrand B. 2002. Biotechnological applications for the improvement of coffee Coffea arabica L.. In Vitro Cellular and Developmental Biology. 38:129-138. Evans DA, Sharp WA, Flick CE. 1981. Growth and behavior of cell cultures. In Embryogenesis and Organogenesis in Pant Tissue Culture: Methods and Application in Agriculture Thorpe, T.A ed. New York US. Academic Press. p. 45-59. George FF, Sherrington PD. 1984. Plant Propagation by Tissue Culture. England GB. Exegetic Ltd. 709p. Giridhar P, Kumar V, Indu EP, Ravishankar, Chandrasekar A. 2004. Thidiazuron induced somatic embryogenesis in Coffea arabica L. and Coffea canephora P ex Fr. Acta Botanica Croatica. 63 1: 25-33. Gray DJ. 2005. Propagation from Nonmeristematik Tissue Culture: Non Zygotic Embryogenesis. In Trigano, R.N. and D. J. Gray Eds. New York US. RCR Press. LLC. hlm187-200. Ibrahim MSD, Sudarsono, Rubiyo, Syafaruddin. 2012. Pengaruh komposisi media terhadap pembentukan kalus menuju induksi embrio somatik kopi Arabika Coffea arabica. Buletin Riset Tanaman Rempah dan Aneka Tanaman Industri 3 1: 13-22. Mene´ndez-Yuffa A, Dominique Barry-Etienne D, Bertrand B, George F, Etienne H. 2010. A comparative analysis of the development and quality of nursery plants derived from somatic embryogenesis and from seedlings for large- scale propagation of coffee Coffea arabica L.. Plant Cell Tiss Organ Cult 102: 297 –307. Neuenschwander B, Baumann TW. 1992. A novel type of somatic embryogenesis in Coffea arabica. Plant Cell Rep. 10: 608-612. 37 Oktavia F, Siswanto, Budiani A, Sudarsono. 2003. Embriogenesis somatik langsung dan regenerasi planlet kopi Arabika Coffea arabica dari berbagai eksplan Menara Perkebunan 71 2: 44-55. Priyono, Danimihardja S. 1991. Reproduksi embrio somatik kopi Arabika dengan menggunakan BAP dan Kinetin serta regenerasi planlet dengan menggunakan Ca-P dan biotin. Dalam Prosiding Seminar Bioteknologi Perkebunan dan Lokakarya Biopolimer Untuk Industri. Pusat Antar Universitas IPB. Bogor ID. 10-11 Desember 1991. Priyono. 1993. Embriogenesis somatik langsung pada kultur in vitro eksplan daun kopi Arabika Coffea arabica. Jurnal Pertanian Indonesia. 3l: 16-20. Priyono. 2004. Kultur in vitro daun kopi untuk mengetahui kemampuan embriogenesis somatik beberapa varietas kopi. Pelita Perkebunan 20 3: 110-122. Quiroz-Figueroa FR, Fuentes-Cerda CFJ, Rojas-Herrera R, Loyola-Vargas VM. 2002. Histological studies on the developmental stages and differentiation of two different somatic embryogenesis systems of Coffea arabica. Plant Cell Reports . 20:1141 –1149. Riyadi A. Tirtoboma. 2004. Pengaruh 2,4-D terhadap induksi embrio somatik kopi Arabika. Buletin Plasma Nutfah 10 2: 82-89. Samson NP, Campa C, Le Gal L, Noirot M, Thomas G, Lokeswari TS, Kochko A.de. 2006. Effect of primary culture medium composition on high frequency somatic embryogenesis in different Coffea species. Plant Cell Tissue and Organ Culture . 86:37-45. Santana-Buzzy,N, Rojas-Herrera R, Galaz-Ávalos RM, Ku-Cauic JR, Mijangos- Cortés J, Gutierrez-Pache LC, Canto A, Quiroz-Figueroa F, Loyala-Vatgas VM. 2007. Advances in coffee tissue culture and its practical applications. In Vitro Cellular Developmental Biology 43: 507-520. Tores KC. 1989. Tissue Culture Techniquest for Horticultural Crops. Van Nostrand Reinhold. New York US. 285 hlm. Wattimena GA, Gunawan LW, Mattjik NA, Syamsudin E, Wiendi NMA, Ernawati A. 1992. Bioteknologi Tanaman. Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman . Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Pusat antar Universitas Bioteknologi. IPB. 309 hlm. Williams EG, Maheswara. 1986. Somatic embryogenesis factors influencing coordinated behaviour of cells as on embryogenic group. Ann. Bot. 57: 443- 462. Zimmerman JL. 1993. Somatic embryogenesis : A. model for early development in higher plants. The Plant Cell. 5: 1411-1423. 38 39

4. INDUKSI EMBRIOGENESIS SOMATIK LANGSUNG DAN TIDAK LANGSUNG MENGGUNAKAN 2,4-D DAN

THIDIAZURON PADA BEBERAPA GENOTIPE KOPI ARABIKA Abstrak Perbanyakan Coffea arabica L. menggunakan embriogenesis somatik secara langsung maupun tidak langsung memberikan harapan dalam penyediaan bibit dalam jumlah besar. Penelitian ini bertujuan ; 1 Mempelajari sistem regenerasi kopi Arabika melalui pembentukan embrio somatik secara langsung dan tidak langsung, 2 Mengoptimasi pemberian 2,4-D dan thidiazuron terhadap embriogeneis tidak langung pada beberapa genotipe kopi Arabika, 3 Mempelajari perkembangan embrio somatik kopi Arabika, dan 4 Mengkaji kemungkinan induksi embrio somatik sekunder pada kopi Arabika untuk mendukung usaha perbanyakan klonal yang dihasilkan. Penelitian terdiri dari 4 kegiatan yaitu; 1 Embriogenesis somatik kopi Arabika menggunakan 2,4-D dan Thidiazuron, 2 Optimasi pemberian 2,4-D dan Thidiazuron terhadap embriogenesis somatik tidak langsung pada beberapa genotipe kopi Arabika, 3 Morfologi Perkembangan Embrio Somatik Kopi, dan 4 Induksi Embrio Somatik Sekunder Menggunakan Thidiazuron dan BAP pada Media Padat dan Semi Padat. Hasil penelitian menunjukan konsentrasi ZPT mempengaruhi pembentukan embrio, baik pada embriogenesis somatik langsung dan tidak langsung. Varietas dan perlakuan ZPT memberikan pengaruh yang nyata terhadap bobot basah, jumlah torpedo dan kecambah yang dihasilkan namun tidak berpengaruh nyata terhadap persentase pembentukan kalus. Media induksi kalus terbaik yang dapat digunakan untuk perbanyakan tanaman tergantung varietas yang digunakan. Morfologi embrio somatik kopi terlihat normal dimana embrio globular, hati, torpedo, dan kecambah sesuai dengan embriogenesis somatik tanaman dikotil pada umumnya. Persentase dan jumlah embrio somatik sekunder terbanyak dihasilkan dari perlakuan thidiazuron 9.08 µM. Kata Kunci : Coffea arabica L , embrio somatik sekunder, kalus, morphologi, perbanyakan ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Catatan: Sebagian dari bab ini telah dipublikasikan pada Indonesian. J.Agrig.Sci. Vol 14.4 No. 2. Halaman 78-86. Oktober 2013. 40

4. INDUCTION OF DIRECT AND INDIRECT SOMATIC

EMBRYOGENESIS USING 2,4-D AND THIDIAZURON ON SOME GENOTYPES OF ARABICA COFFEE Abstract Propagation of Coffea arabica L. through direct or indirect somatic embryogenesis is expected to supply seeds in large quantities. The aims of this study were 1 Observing Arabica coffee regeneration system through direct and indirect somatic embryo formation, 2 Optimizing the application of 2,4-D and Thidiazuron to the indirect embryogenesis of some Arabica coffee genotypes, 3 Examining the development of Arabica coffee somatic embryos, and 4 Assessing the possibility to induce secondary somatic embryos in Arabica coffee to support clonal propagation. This research comprised of four activities: 1 Somatic embryogenesis of Arabica coffee using 2,4-D and Thidiazuron, 2 Optimization of 2,4-D and Thidiazuron application to the indirect somatic embryogenesis in some Arabica coffee genotypes, 3 Morphological development of somatic embryo of coffee, and 4 The induction of secondary somatic embryos using Thidiazuron and BAP in solid and semi-solid media. The results showed the concentrations of plant growth regulator PGR significantly affected embryo formation, both in direct and indirect somatic embryogenesis. Varieties and PGR treatments indicated significant effect on fresh weight, number of torpedo and number of germinate embryos, but showed no significant result on callus formation percentage. The best callus induction medium for plant propagation was varied, depended on the varieties. The morphology of coffee somatic embryos was normal indicated by the similar form of globular embryo, heart, torpedo, and germinate as in somatic embryogenesis in other dicotyledonous plants. The highest percentage and number of secondary somatic embryos were generated from Thidiazuron 9.08 µM treatment. Keywors : Coffea arabica L , secondary somatic embryos , callus, morphology, propagation ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Note : Section of this chapter has been published in Indonesian. J.Agrig.Sci. Vol 14.4 No. 2. Pages 78-86. October 2013. 41 Pendahuluan Embriogenesis somatik merupakan salah satu tehnik kultur yang dapat dimanfaatkan untuk perbanyakan tanaman kopi Arabika secara klonal. Penelitian embriogenesis somatik kopi Arabika menggunakan kombinasi ZPT yang berbeda telah dilaporkan oleh banyak peneliti. Neuenschwander dan Baumann 1992 telah berhasil menginduksi embrio dengan menggunakan tiga kombinasi ZPT, yaitu Benzyl Amino Purine BAP, 2,4-Diklorofenoksiasetat Acid 2,4-D, dan α-Naphtalene Acetic Acid NAA. Priyono dan Danimihardja 1991 menggunakan BAP dan kinetin. Priyono 1993 menggunakan Indole Asetic Acid IAA, BAP dan Adenine sulfat. Giridhar et al. 2004 menggunakan Thidiazuron, sementara Oktavia et al. 2003, Samson et al. 2006, dan Arimarsetiowati 2011 menggunakan 2,4-D dengan 6-y,y-dimethylallylamino purine 2-iP. Hasil penelitian memperlihatkan bahwa kemampuan eksplan daun untuk membentuk embrio dalam proses embriogenesis somatik kopi sangat dipengaruhi oleh media, ZPT dan genotipe tanaman. Embriogenesis somatik pada tanaman kopi dilaporkan dapat melalui embriogenesis langsung tampa pembentukan kalus dan embriogenesis tidak langsung melalui pembentukan kalus. Pembentukan embrio melalui embriogenesis langsung lebih disukai karena dapat menekan masalah sulitnya pembentukan benih somatik pada tahap perkecambahan Rai Mccomb 2002, dan dapat menekan terjadinya variasi somaklonal. Kelemahannya jumlah bibit yang dihasilkan biasanya lebih sedikit, dan proses perkembangan embrio biasanya kurang serentak jika dibandingkan dengan embrogenesis tidak langsung. Embriogenesis somatik tidak langsung banyak digunakan untuk perbaikan tanaman dengan metoda variasi somaklonal atau diaplikasikan dengan mutasi dan tranformasi gen. Peranan ZPT sangat penting dalam menginduksi embriogenesis somatik. Zat pengatur tumbuh yang paling banyak digunakan untuk memacu pembelahan dan elongasi sel adalah dari golongan sitokinin dan auksin Srivastava 2002. Penelitian Santos-Briones dan Hernández-Sotomayor 2006 serta Samson et al. 2006 memperlihatkan bahwa selain ZPT, kemampuan eksplan daun untuk membentuk embrio dalam proses embriogenesis somatik kopi dipengaruhi oleh genotipe tanaman. Seberapa besar konsentrasi ZPT yang diperlukan pada genotipe tanaman kopi Arabika yang akan digunakan dalam proses perbanyakan tentunya memerlukan penelitian tersendiri untuk mendapatkan hasil yang optimum. Optimasi media umumnya dilakukan untuk meningkatkan kemampuan media dalam menginduksi pembentukan kalus embriogenik, embrio globular, torpedo dan daya kecambah dari eksplan yang dikulturkan. Optimasi media dilakukan dengan berbagai cara, diantaranya memberikan variasi konsentrasi 2,4-D dan Thidiazuron yang ditambahkan dalam media kultur pada beberapa genotipe tanaman. Embriogenesis somatik tanaman juga dapat dioptimasi dengan memanfaatkan pembentukan embrio sekunder. Embrio somatik sekunder adalah pembentukan embrio somatik dari embrio somatik primer. Beberapa keuntungan menggunakan embrio somatik sekunder adalah ; ketersedian eksplan steril yang dapat langsung digunakan untuk perbanyakan, proses penyediaan eksplan bisa lebih cepat karena tidak perlu menginduksi embrio somatik dari luar, dan dapat digunakan untuk memperbanyak tanaman hasil mutasi maupun hasil transformasi genetik. 42 Pembentukan embrio somatik sekunder berkelanjutan dari embrio somatik primer pada kopi dapat dimanfaatkan untuk tujuan perbanyakan tanaman klonal dan pemuliaan tanaman terutama dengan metoda rekayasa genetik Fernández-Da et al . 2005. Secara umum penelitian pembentukan embrio somatik sekunder yang mengikuti proses embrio somatik primer pada kopi Arabika tidak banyak dilaporkan. Keberhasilan regenerasi melalui embriogenesis somatik dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara lain formulasi media yang berbeda pada setiap tahap perkembangan embrio somatik, jenis eksplan yang digunakan, kombinasi dan konsentrasi ZPT, dan genotipe tanaman. Penelitian ini bertujuan ; 1 Mempelajari sistem regenerasi kopi Arabika melalui pembentukan embrio somatik secara langsung dan tidak langsung, 2 Mengoptimasi pemberian 2,4-D dan Thidiazuron terhadap embriogeneis tidak langung pada beberapa genotipe kopi Arabika, 3 Mempelajari perkembangan embrio somatik kopi Arabika, dan 4 Mengkaji kemungkinan induksi embrio somatik sekunder pada kopi Arabika untuk mendukung usaha perbanyakan klonal yang dihasilkan. Bahan dan Metode Penelitian dilakukan di laboratorium kultur jaringan tanaman dan rumah kaca, Unit Pengembangan Benih Unggul Pertanian, dari Juni 2012 sampai April 2015. Penelitian ini terdiri dari empat tahapan kegiatan yaitu; 1 Embriogenesis somatik kopi Arabika menggunakan 2,4-D dan Thidiazuron, 2 Optimasi 2,4-D dan Thidiazuron pada beberapa genotipe kopi Arabika, 3 Morfologi Perkembangan Embrio Somatik Kopi Arabika, dan 4 Induksi Embrio Somatik Sekunder Menggunakan Thidiazuron dan BAP. 1 . Embriogenesis Somatik Kopi Arabika Menggunakan 2,4-D dan Thidiazuron - Induksi Kalus Medium dasar yang digunakan untuk induksi kalus adalah 12 konsentrasi garam makro dan mikro MS Murashige and Skoog yang dilengkapi dengan vitamin B5, sukrosa 30 g L -1 , dan 250 mg L -1 Poliviynil polipyrolidon PVPP. Sebagai bahan pemadat ditambahkan phytagel 2.5 g L -1 . Perlakuan yang diuji yaitu; 1 2,4-D 2.26 µM + thidiazuron 4.54 µM, 2 2,4-D 2.26 µM + thidiazuron 9.08 µM, 3 2,4-D 4.52 µM + thidiazuron 4.54 µM, 4 2,4-D 4.52 µM + thidiazuron 9.08 µM, dan 5 2,4-D 9.04 µM + thidiazuron 9.08 µM. Media disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C selama 20 menit dengan tekanan 1.5 atm. Eksplan berupa daun muda diambil dari tanaman kopi Arabika varietas Kartika yang telah ditumbuhkan di rumah kaca. Daun dibersihkan dengan air mengalir selama 10 menit, disterilisasi menggunakan larutan 0.2 Dithane M-45 dan Agrimicin 0.1 selama 30 menit, lalu dibilas sampai bersih. Di laminar air flow, daun direndam dalam alkohol 50 selama 5 menit dilanjutkan dengan Calsium hipoklorit 10 selama 10 menit. 43 Daun yang telah steril dibilas sampai bersih dengan air steril sebanyak 3 kali, dipotong dengan ukuran ± 1 cm x 1 cm, dan ditanam dalam media induksi kalus. Kultur diinkubasi dalam ruang gelap pada temperatur ± 25 o C dan kelembaban relatif ± 60. Satu bulan dimedia induksi kalus, eksplan yang membentuk kalus dipindahkan ke media induksi kalus lanjutan yang mengandung 12 konsentrasi garam makro dan mikro MS, vitamin B5 yang dimodifikasi, sukrosa 30 g L -1 , Phytagel 2.5 g L -1 , dan penambahan zat pengatur tumbuh 2,4-D 4.50 µM dan BAP 17.75 µM Etienne 2005. Percobaan dilakukan dengan sepuluh ulangan. Satu ulangan terdiri dari 5 potongan daun. Peubah yang diamati meliputi persentase pembentukan kalus dan berat kalus yang terbentuk. - Induksi Embrio Somatik Kalus embriogenik yang telah terbentuk dipindahkan ke media 12 konsentrasi garam makro dan mikro MS, vitamin B5 yang dimodifikasi, sukrosa 30 g L -1 , phytagel 2.5 g L -1 dengan penambahan zat pengatur tumbuh kinetin 9.30 µM. Kultur diinkubasi dalam ruangan gelap yang bersuhu 25 °C. Perlakuan diulang sebanyak 10 kali, dimana setiap ulangan terdiri atas satu botol yang berisi klam kalus dengan berat masing-masing ± 100 mg kalus. Masing-masing perlakuan dikulturkan sebanyak ± 5.000 mg kalus. Peubah yang diukur adalah persen kalus yang membentuk embrio somatik. - Pengecambahan Embrio Somatik dan Regenerasi Tanaman Embrio fase torpedo dipindahkan ke medium perkecambahan yang mengandung 12 konsentrasi garam makro dan mikro MS, vitamin B5 yg dimodifikasi, sukrosa 40 g L -1 . Perkecambahan embrio dilakukan dalam penyinaran selama 16 jam, dengan intensitas cahaya 1.000-1.500 luks pada suhu 25 o C dengan kelembaban relatif ± 60. Percobaan dilakukan dengan 10 ulangan. Peubah yang diamati jumlah kecambah yang terbentuk. - Analisis Data Penelitian menggunakan rancangan acak lengkap. Jika terdapat perbedaan yang nyata dari nilai rata-rata perlakuan maka dilakukan uji lanjut dengan mengunakan Duncan Multiple Range Test DMRT pada taraf uji 5 α = 0.05.

2. Optimasi 2,4-D dan Thidiazuron pada Beberapa Genotipe Kopi Arabika

Penelitian tahap ke dua ini dilakukan untuk mengoptimasi kegiatan yang telah dilakukan pada tahap pertama. Optimasi yang dilakukan dengan mengembangkan konsentrasi ZPT Thidiazuron yang digunakan untuk menginduksi kalus embriogenik dan menambah genotipe tanaman kopi Arabika yang digunakan. Genotipe kopi Arabika yang digunakan adalah varietas Kartika, AS2K, Sigarar Utang dan S 795. Daun muda diambil dan dibersihkan dengan air mengalir. Daun disterilisasi menggunakan larutan 0.2 Dithane M-45 dan Agrimicin 0.1 selama 30 menit, lalu dibilas sampai bersih. Daun disterilisasi dalam alkohol 50 selama 5 menit dilanjutkan dengan Calsium hipoklorit 10 selama 10 menit.