43
Daun yang telah steril dibilas sampai bersih dengan air steril sebanyak 3 kali, dipotong dengan ukuran ± 1 cm x 1 cm, dan ditanam dalam media induksi
kalus. Kultur diinkubasi dalam ruang gelap pada temperatur ± 25
o
C dan kelembaban relatif ± 60.
Satu bulan dimedia induksi kalus, eksplan yang membentuk kalus dipindahkan ke media induksi kalus lanjutan yang mengandung 12 konsentrasi
garam makro dan mikro MS, vitamin B5 yang dimodifikasi, sukrosa 30 g L
-1
, Phytagel 2.5 g L
-1
, dan penambahan zat pengatur tumbuh 2,4-D 4.50 µM dan BAP 17.75 µM Etienne 2005. Percobaan dilakukan dengan sepuluh ulangan.
Satu ulangan terdiri dari 5 potongan daun. Peubah yang diamati meliputi persentase pembentukan kalus dan berat kalus yang terbentuk.
-
Induksi Embrio Somatik
Kalus embriogenik yang telah terbentuk dipindahkan ke media 12 konsentrasi garam makro dan mikro MS, vitamin B5 yang dimodifikasi, sukrosa
30 g L
-1
, phytagel 2.5 g L
-1
dengan penambahan zat pengatur tumbuh kinetin 9.30 µM. Kultur diinkubasi dalam ruangan gelap yang bersuhu 25 °C. Perlakuan
diulang sebanyak 10 kali, dimana setiap ulangan terdiri atas satu botol yang berisi klam kalus dengan berat masing-masing ± 100 mg kalus. Masing-masing
perlakuan dikulturkan sebanyak ± 5.000 mg kalus. Peubah yang diukur adalah persen kalus yang membentuk embrio somatik.
-
Pengecambahan Embrio Somatik dan Regenerasi Tanaman
Embrio fase torpedo dipindahkan ke medium perkecambahan yang mengandung 12 konsentrasi garam makro dan mikro MS, vitamin B5 yg
dimodifikasi, sukrosa 40 g L
-1
. Perkecambahan embrio dilakukan dalam penyinaran selama 16 jam, dengan intensitas cahaya 1.000-1.500 luks pada suhu
25
o
C dengan kelembaban relatif ± 60. Percobaan dilakukan dengan 10 ulangan. Peubah yang diamati jumlah kecambah yang terbentuk.
-
Analisis Data
Penelitian menggunakan rancangan acak lengkap. Jika terdapat perbedaan yang nyata dari nilai rata-rata perlakuan maka dilakukan uji lanjut dengan
mengunakan Duncan Multiple Range Test DMRT pada taraf uji 5 α = 0.05.
2. Optimasi 2,4-D dan Thidiazuron pada Beberapa Genotipe Kopi Arabika
Penelitian tahap ke dua ini dilakukan untuk mengoptimasi kegiatan yang telah dilakukan pada tahap pertama. Optimasi yang dilakukan dengan
mengembangkan konsentrasi ZPT Thidiazuron yang digunakan untuk menginduksi kalus embriogenik dan menambah genotipe tanaman kopi Arabika
yang digunakan. Genotipe kopi Arabika yang digunakan adalah varietas Kartika, AS2K, Sigarar Utang dan S 795.
Daun muda diambil dan dibersihkan dengan air mengalir. Daun disterilisasi menggunakan larutan 0.2 Dithane M-45 dan Agrimicin 0.1 selama 30 menit,
lalu dibilas sampai bersih. Daun disterilisasi dalam alkohol 50 selama 5 menit dilanjutkan dengan Calsium hipoklorit 10 selama 10 menit.
44
Daun yang telah steril dibilas sampai bersih menggunakan air steril sebanyak 3 kali. Daun dipotong dengan ukuran ± 1 cm x 1 cm, dan ditanam dalam
media induksi kalus. Kultur diinkubasi dalam ruang gelap pada temperatur ± 25
o
C dan kelembaban relatif ± 60.
Medium dasar yang digunakan untuk induksi kalus adalah 12 konsentrasi garam makro dan mikro MS Murashige and Skoog yang dilengkapi dengan
vitamin B5, sukrosa 30 g L
-1
, dan 250 mg L
-1
, Poliviynil polipyrolidon PVPP, dan kemudian ditambahkan phytagel 2.5 g L
-1
. Kombinasi zat pengatur tumbuh 2,4-D dan Thidiazuron yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Kombinasi zat pengatur tumbuh 2,4-D danThidiazuron
Perlakuan 2,4-D
Thidiazuron
1 4.5β μM
4.54 μM
2 4.5β μM
9.08 μM
3 4.5β μM
13.62 μM
4 4.5β μM
18.16 μM
5 4.5β μM
22.70 μM
6 9.04 μM
4.54 μM
7 9.04 μM
9.08 μM
8 9.04 μM
13.62 μM
9 9.04 μM
18.16 μM
10 9.04
μM 22.70
μM Percobaan dilakukan dengan sepuluh ulangan. Satu ulangan terdiri dari 5
potongan daun. Peubah yang diamati meliputi persentase pembentukan kalus dan bobot basah kalus yang terbentuk. Media induksi kalus lanjutan, induksi embrio
somatik, regenerasi dan perkecambahan yang digunakan sama dengan media yang digunakan pada tahap pertama. Pada induksi embrio somatik perlakuan diulang
sebanyak 10 kali, dimana setiap ulangan terdiri atas satu botol yang berisi klam kalus dengan berat masing-masing ± 200 mg kalus, sehingga untuk masing-
masing perlakuan dikulturkan sebanyak ± 5.000 mg kalus. Peubah yang diukur adalah persen kalus yang membentuk embrio somatik. Perkecambahan embrio
dilakukan dengan sepuluh ulangan. Peubah yang diamati jumlah kecambah yang terbentuk.
-
Analisis Data
Data yang diperoleh akan diuji secara statistik dengan metode 2 faktor untuk mencari nilai anova atau sidik ragamnya. Jika terdapat perbedaan yang nyata akan
dilakukan uji lanjut dengan Duncan Multiple Range Test DMRT pada taraf uji 5.
3. Morfologi Perkembangan Embrio Somatik Kopi Arabika
Perkembangan embrio somatik kopi Arabika dari mulai pembentukan kalus, embrio globular sampai planlet diamati dengan menggunakan mikroskop
AxioVision type Zeiss. Mikroskop dihubungkan dengan komputer dengan program AxioVision Release 4.82.
