PENGGUNAAN ZAT PENGATUR TUMBUH ALTERNATIF PADA MEDIA INDUKSI KALUS UNTUK MENDUKUNG
65
Media MS dengan konsentrasi setengah digunakan untuk induksi kalus. Media ditambahkan sukrosa 30 g L
-1
, poliynil polypyrolidon PVPP 250 mg L
-1
, phytagel 2.5 g L
-1
, dan pH diatur menjadi 5.6. Perlakuan yang diuji dapat dilihat pada tabel 8. Media disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121
o
C selama 20 menit dengan tekanan 1.5 atm.
Perlakuan diulang 10 kali. Setiap ulangan terdiri dari satu botol berisi 7 eksplan. Eksplan yang telah dipotong dimasukkan ke media induksi kalus, lalu
diinkubasi dalam kondisi gelap pada suhu ± 25
o
C. Satu bulan di media induksi kalus, eksplan disubkultur ke media induksi
kalus lanjutan mengandung konsentrasi media setengah MS dan vitamin yang dimodifikasi. Media ditambahkan casein hidrolisate 200 mg L
-1
, malt extract 800 mg L
-1
, 2,4-D 4. 5β μM, BAP 17.76 μM, sukrosa γ0 g L
-1
, dan phytagel 2.5 g L
-1
van Boxtel Berthouly 1996. Kultur diinkubasi dalam kondisi gelap pada ± 25
o
C. Kalus embriogenik disubkultur ke media 12 konsentrasi garam makro dan mikro MS, vitamin B5 yang dimodifikasi, sukrosa 30 g L
-1
, phytagel 2,5 g L
-1
dengan penambahan ZPT kinetin 9.γ0 μM. Perlakuan diulang sebanyak 10 kali, dimana setiap ulangan terdiri atas satu
botol yang berisi satu klam kalus dengan berat masing-masing ± 200 mg. Kultur diinkubasi dalam ruangan gelap bersuhu 25°C. Embrio fase kotiledonari
disubkultur ke media pendewasaan Etienne 2005. Kultur diinkubasi dalam kondisi terang pada ± 25
o
C dengan intensits penyinaran 1000-1500 luks dan kelembaban relatif ± 60.
Analisa Statistik dan Peubah yang Diamati
Analisa statistik mengunakan rancangan acak lengkap 2 faktor dengan Faktor pertama ZPT dan yang kedua genotipe tanaman. Jika terdapat beda nyata
antara perlakuan, akan dilakukan uji lanjut menggunakan Duncan pada taraf 5. Pengamatan dilakukan pada persentase pembentukan kalus dan berat basah kultur
dalam media induksi kalus lanjutan, jumlah embrio somatik torpedo, jumlah kecambah, dan morfologi perkembangan embrio. Tahapan perkembangan
embriogenesis somatik kopi Arabika dari mulai pembentukan kalus sampai kotiledonari diamati dengan menggunakan mikroskop.
Tabel 8. Kombinasi perlakuan zat pengatur tumbuh 2,4-D dan 2-iP
Perlakuan 2,4-D
2-iP
1 4.5β μM
4.9γ μM 2
4.5β μM 9.86 μM
3 4.5β μM
14,79 μM 4
4.5β μM 19.7β μM
5 4.5β μM
β4.65 μM 6
9.04 μM 4.9γ μM
7 9.04 μM
9.86 μM 8
9.04 μM 14,79 μM
9 9.04 μM
19.7β μM 10
9.04 μM β4.65 μM
66
Pada percobaan ini selain melihat perkembangan embrio somatik tidak langsung pada kopi Arabika, juga dilakukan histologi dari mulai pembentukan
kalus dari eksplan daun sampai tahapan kotiledonari. Eksplan daun yang berumur 8 minggu setelah kultur, embrio globular, oblong, hati, embrio memanjang,
torpedo, dan kotiledonari digunakan sebagai bahan histologi. Proses pembuatan irisan transversal mengikuti metode parafin dari Sass yang telah dimodifikasi.
Jaringan yang hendak dihistologi kemudian disayat menggunakan mikrotom putar rotary microtom dengan ketebalan
sayatan 10 μm, kemudian diwarnai dengan safranin 1 dan fastgreen 0,5 .
Pemeriksaan tahapan perkembangan embrio somatik dan histologi jaringan dilakukan dengan mengamati tampilan mikroskopis dari sampel dan preparat.
Pengamatan menggunakan mikroskop AxioVision type Zeiss. Dokumentasi dilakukan dengan menghubungkan mikroskop dengan komputer program
AxioVision Release 4.82. 2.
Induksi Embrio Somatik Sekunder Coffea arabica L.
Eksplan yang digunakan untuk menginduksi embrio somatik sekunder ESS adalah embrio somatik primer ESP fase torpedo kopi Arabika var.AS2K
Varietas AS2K merupakan varietas yang paling responsif dalam menghasilkan embrio somatik primer dan merupakan varietas yang lebih tahan terhadap karat
dibandingkan varietas lainnya. Media setengah MS yang ditambahkan 2-iP 4.54 dan
9.08 μM, kinetin 9.γ0 μM dan BAP 1.γγ μM dengan media padat dan semi padat diuji sebagai perlakuan. Eksplan yang membentuk ESS disub kultur ke
pendewasaan. Kultur diinkubasi dalam ruang gelap dengan suhu ± 25
o
C sampai terbentuk ESS.
Analisa statistik dan peubah yang diamati
Analisis statistik menggunakan rancangan acak lengkap. Percobaan dilakukan dengan sepuluh ulangan. Satu ulangan terdiri dari 10 embrio fase
torpedo. Peubah yang diamati meliputi: persentase pembentukan ESS dan jumlah ESS yang dihasilkan.
3.
Aklimatisasi Planlet Coffea arabika L. Hasil Embriogenesis Somatik
Planlet dengan tinggi kurang lebih 4 cm dan telah mempunyai 4 pasang daun dikeluarkan dari botol kultur. Akar dicuci dengan air mengalir, kemudian
direndam larutan fungisida bahan aktif Benlate 0.2 selama ± 5 menit. Planlet ditanam dalam pot plastik yang berisi campuran tanah yang telah disterilkan.
Perlakuan yang diuji adalah media tanam dengan komposisi: tanah, pupuk kandang dan pasir dengan perbandingan 1:1:1 TPS; tanah, kompos dan pasir
dengan perbandingan 1:1:1TKP ; tanah, pupuk kandang, arang sekam dan pasir dengan perbandingan 1:1:1:1 TPAS dan tanah, arang sekam dan pasir dengan
perbandingan 1:1:1 TAS. Untuk menjaga suhu dan kelembaban, Planlet kemudian disungkup botol kaca selama ± 4 minggu.