Induksi Embrio Somatik Sekunder Menggunakan Thidiazuron dan BAP

60 Raghavan V. 1986. Embryogesis in angiosperms : A developmental and experimented study. Cambridge. Cambrige University Press. Sakakibara. H. 2004. Cytokinin biosynthesis and metabolism. Pp. 95-114. In. Davies, P.J. Ed.. Plant Hormones: Biosynthesis, Signal, Action. Third Edition. London GB. Kluwer Academic Publishers. Samson NP, Campa C, Le Gal L, Noirot M, Thomas G, Lokeswari TS, Kochko A.de. 2006. Effect of primary culture medium composition on high frequency somatic embryogenesis in different Coffea species. Plant Cell Tissue and Organ Culture . 86:37-45. Santos-Briones CDL, Hernández-Sotomayor SMT. 2006. Coffee biotechnology. Braz. Jurnal Plant Physiol. 181: 217-227. Srivastava LM. 2002. Plant Growth and Development. New York US. Academic Press. 772p. Tores, KC. 1989. Tissue Culture Techniquest for Horticultural Crops.Van Nostrand Reinhold. New York. 285 p. Williams EG, Maheswara. 1986. Somatic embryogenesis factors influencing coordinated behaviour of cells as on embryogenic group. Ann. Bot. 57: 443- 462. Yeung EC. l995. Structural and development patterns in somatic embryogenesis. In: Thorpe TA ed In vitro embryogenesis in plants. Dordrecht NL. Kluwer. pp 205-247. Zimmerman JL. 1993. Somatic embryogenesis : A. model for early development in higher plants. The Plant Cell. 5: 1411-1423. 61

5. PENGGUNAAN ZAT PENGATUR TUMBUH ALTERNATIF PADA MEDIA INDUKSI KALUS UNTUK MENDUKUNG

PERKEMBANGAN EMBRYOGENESIS SOMATIK PRIMER DAN SEKUNDER KOPI ARABIKA Abstrak Perbanyakan kopi melalui embriogenesis somatik tidak langsung dan pembentukan embrio sekunder merupakan teknik yang menjanjikan untuk memproduksi benih kopi dalam skala besar. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan komposisi media terbaik dalam menginduksi embriogenesis somatik tidak langsung dan pembentukan embrio somatik sekunder, mendapatkan komposisi media tanam yang sesuai untuk aklimatisasi tanaman kopi, dan mengevaluasi seberapa besar variasi tanaman yang dihasilkan dari embriogenesis somatik. Genotipe yang diuji terdiri dari 3 varietas yaitu ; Andung Sari 2K, S 795, dan Sigarar Utang. Kombinasi zat pengatur tumbuh yang diuji adalah 2,4-D 4.50 dan 9.00 µM dan 2-iP 4,54; 9,08 ; 13,62 dan 22,70 µM. Parameter yang diamati adalah persentase pembentukan kalus, bobot basah, jumlah torpedo dan kecambah yang dihasilkan. Morfologi dan histologi embriogenesis somatik diamati dengan mengunakan mikroskop Axsio. Hasil penelitian memperlihatkan media induksi embriogenesis somatik tergantung pada varietas yang digunakan. Media dengan penambahan 2,4-D 4.52 dan 2-iP 19.72 µM merupakan media terbaik untuk varietas AS2K, sementara untuk varietas S 795 dan Sigarar Utang pada media 2,4-D 4.52 dan 2-iP 14.79 µM. Penambahan BAP 17.76 µM menghasilkan persentase tertinggi 78 dengan jumlah embrio somatik sekunder terbanyak 6.92 dibandingkan ketiga perlakuan lainnya. Penggunaan media tanam yang diberi arang sekam dan pupuk kandang dan pasir memberikan hasil terbaik dalam proses aklimatisasi. Pengamatan molekuler pada sampel yang diuji memperlihatkan tidak adanya variasi somaklonal dari planlet yang dihasilkan. Kata kunci : Aklimatisasi, Coffea arabica L., histologi, variasi somaklonal, marka molekuler 62

5. THE APPLICATION OF ALTERNATIVE PLANT

GROWTH REGULATOR ON CALLUS MEDIA INDUCTION TO SUPPORT THE DEVELOPMENT OF PRIMARY AND SECONDARY SOMATIC EMBRYOGENESIS OF ARABICA COFFEE Abstrak Seedling propagation of Coffea arabica L. through indirect somatic embryogenesis and the formation of secondary embryo are potential tools to produce a large quantity of seedlings. The objectives of this research were to 1 obtain the best media composition to induce indirect primary somatic embryogenesis and the formation of secondary embryo, 2 to get the composition of growth media suitable for acclimatization of coffee plantlets, and 3 to evaluate the variation of plantlets generated from somatic embryogenesis. Genotypes tested were Andung Sari 2K, S 795, and Sigarar Utang varieties, while PGR combination treatments were 2,4-D 4.50 and 9.00 µM and 2-iP 4.54, 9.08, 13.62 and 22.70 µM. Parameters observed were callus formation percentage, fresh weight of callus and number of torpedo and germinate. The morphology and histology of somatic embryogenesis was examined using Axsio microscope. The result indicated that media to induce somatic embryogenesis depended on variety. Media added with 2,4-D 4.52 and 2-iP 19.72 µM were the best for AS2K variety. Meanwhile, the best media for S 795 and Sigarar Utang varieties were media supplemented with 2,4-D 4.52 and 2-iP 14.79 µM. The application of BAP 17.76 µM produced the highest callus formation percentage 78 and secondary somatic embryo 6.92. Media consisted of soil, husk, manure and sand was the best media for acclimatization. Molecular observation on sample tested revealed no somaclonal variation among plantlets. Keywords : Aclimatization, Coffea arabica L, histology, somaclonal variation, molecular marker 63 Pendahuluan Penelitian embriogenesis somatik kopi Arabika Coffea arabica L. telah dikembangkan untuk mendapatkan metoda perbanyakan tanaman. Teknik perbanyakan ini lebih sesuai untuk kopi, karena memungkinkan perbanyakan klonal skala besar dengan biaya produksi yang lebih rendah Etienne 2005; Kumar et al. 2006. Aplikasi penting dari embriogenesis somatik kopi Arabika adalah untuk mendapatkan teknik perbanyakan yang cepat, seragam dan sama dengan induknya. Penelitian embriogenesis somatik tidak langsung telah banyak dikembangkan untuk memproduksi berbagai genotipe kopi. Penelitian yang mengarah kepada tahap awal pembentukan kalus embriogenik kopi sering menjadi fokus utama di laboratorium kultur in vitro ternama. Perbedaan konsentrasi maupun jenis zat pengatur tumbuh ZPT banyak diteliti dalam proses pembentukan kalus embriogenik dan regenerasi kopi Arabika. Hal ini dilakukan tidak lain untuk dapat meningkatkan jumlah embrio somatik kopi Arabika yang dihasilkan. Induksi embrio somatik kopi Arabika menggunakan kombinasi beberapa ZPT telah berhasil dilakukan. Kombinasi benzyl amino purine BAP, 2,4- diklorofenoksiasetat acid 2,4-D, dan α-naphtalene acetic acid NAA telah berhasil dilakukan Neuenschwander dan Baumann 1992. Priyono 1993 menggunakan kombinasi indole asetic acid IAA dan BAP yang diberi adenine sulfat . Giridhar et al. 2004 hanya menggunakan Thidiazuron. Ahmed et al. 2013 menggunakan kombinasi 2,4-D, IAA dan BAP. Rezende et al. 2012 dan Etienne 2005 menggunakan kombinasi 2,4-D, IBA and 6-y,y- dimethylallylamino purine 2-iP , sementara Arimarsetiowati 2011, Samson et al . 2006, dan Oktavia et al. 2003 menggunakan 2,4-D dengan 2-iP. Penelitian embriogenesis kopi Arabika pada BAB terdahulu telah berhasil dengan menggunakan kombinasi 2,4-D dengan thidiazuron. Mahalnya harga thidiazuron menyebabkan biaya menghasilkan tanaman kopi Arabika melalui embriogenesis somatik akan menjadi tinggi. Hal ini akan berdampak pada harga bibit yang menjadi mahal. Penggunaan ZPT yang lebih murah perlu menjadi pertimbangan untuk menurunkan biaya produksi benih embriogenesis somatik. Penelitian beberapa varietas kopi Arabika menggunakan 2,4-D dan sitokinin 2-iP dalam embriogenesis somatik langsung telah dilakukan oleh Oktavia et al 2003 dan Arimarsetiowati 2011. Penelitian tersebut menyatakan penambahan 2,4-D 1-5 µM dan 2-iP 1-20 µM mampu menginduksi pembentukan embrio somatik langsung pada kopi Arabika. Perkembangan embrio yang tidak seragam, dan jumlah embrio yang dihasilkan lebih sedikit pada embriogenesis langsung, merupakan hal yang kurang diminati dalam proses perbanyakan benih kultur jaringan. Selain pembentukan embrio somatik primer, pembentukan embrio somatik sekunder berkelanjutan dari embrio somatik primer juga dapat dimanfaatkan untuk tujuan perbanyakan tanaman klonal, dan perbaikan genetik tanaman Fernández-Da et al. 2005. Penelitian embrio somatik sekunder pada kopi Arabika tidak banyak dilaporkan, sehingga induksi embrio somatik sekunder dari embrio somatik primer dengan proliferasi yang tinggi perlu dikaji untuk mendukung perbanyakan klonal. 64 Variasi somaklonal dalam perbanyakan kultur jaringan dapat terjadi apabila metode yang dihasilkan belum tepat. Variasi somaklonal merupakan kejadian abnormalitas yang dapat terjadi pada perbanyakan in vitro oleh karena mutasi atau perubahan sekuens, aktivasi gen, dan pembungkaman gen Kaeppler et al. 2000. Variasi tersebut dapat dideteksi melalui karakterisasi morfologi Zhao et al. 2005; Podwyszyńska β005 ; Noor et al. 2009; Somsri et al. 2009, sitologi Al-Zahim et al. 1999, biokimia, fisiologi Perez et al. 2011, dan molekuler Chen et al. 1998; Soniya et al. 2001. Diantara ke lima karakterisasi tersebut, penggunaan teknik molekuler dinilai lebih akurat karena tidak bias oleh faktor lingkungan, dan tidak tergantung fase perkembangan tanaman. Deteksi dini menggunakan marka molekular sangat diperlukan untuk memastikan metoda yang digunakan tidak sampai menimbulkan keragaman genetik. Salah satu marka molekuler yang banyak digunakan untuk melihat keragaman genetik kopi adalah Simple Sequance Repeat SSR Geleta et al. 2012. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan komposisi media terbaik dalam menginduksi embriogenesis somatik tidak langsung dan pembentukan embrio somatik sekunder, mendapatkan komposisi media tanam yang sesuai untuk aklimatisasi tanaman kopi, dan mengevaluasi variasi tanaman yang dihasilkan oleh embriogenesis somatik. Bahan dan Metoda Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman dan rumah kaca, Unit Pengembangan Benih Unggul Pertanian, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian Indonesia, Laboratorium Morfologi Anatomi dan Sitologi Tumbuhan, Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Laboratorium Biologi Melekular, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Tanaman dan Laboratorium, Biologi Molekuler Tanaman Departemen Agronomi dan Hortikultura, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung dari Juni 2012 sampai Mei 2015. Penelitian terdiri dari 5 kegiatan yaitu ; 1 Embriogenesis Somatik Coffea arabica L menggunakan - 2,4-D dan 2-iP, 2 Induksi Embrio Somatik Sekunder Coffea arabica L, 3 Aklimatisasi Planlet Coffea arabika L. Hasil Embriogenesis Somatik, 4 Deteksi Dini Variasi Somaklonal Coffea arabika L.

1. Embriogenesis Somatik Coffea arabica L menggunakan 2,4-D dan 2-iP

Daun muda kopi Arabika Var. AS2K, Sigarar Utang, dan S 795 yang ditumbuhkan di rumah kaca digunakan sebagai eksplan. Daun dibersihkan menggunakan air mengalir selama 10 menit, direndam dengan fungisida bahan aktif mancozeb 80, konsentrasi 0,2 selama 1 jam, dan dibilas dengan aquadest. Daun dibawa ke laminar air flow, disterillisasi dengan cara direndam dalam etanol 70 selama 3 menit diikuti hipoklorit 10 selama 15 menit. Daun dibilas 3 kali menggunakan aquadest steril, kemudian dipotong dengan ukuran ± 1 cm x 1 cm. 65 Media MS dengan konsentrasi setengah digunakan untuk induksi kalus. Media ditambahkan sukrosa 30 g L -1 , poliynil polypyrolidon PVPP 250 mg L -1 , phytagel 2.5 g L -1 , dan pH diatur menjadi 5.6. Perlakuan yang diuji dapat dilihat pada tabel 8. Media disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C selama 20 menit dengan tekanan 1.5 atm. Perlakuan diulang 10 kali. Setiap ulangan terdiri dari satu botol berisi 7 eksplan. Eksplan yang telah dipotong dimasukkan ke media induksi kalus, lalu diinkubasi dalam kondisi gelap pada suhu ± 25 o C. Satu bulan di media induksi kalus, eksplan disubkultur ke media induksi kalus lanjutan mengandung konsentrasi media setengah MS dan vitamin yang dimodifikasi. Media ditambahkan casein hidrolisate 200 mg L -1 , malt extract 800 mg L -1 , 2,4-D 4. 5β μM, BAP 17.76 μM, sukrosa γ0 g L -1 , dan phytagel 2.5 g L -1 van Boxtel Berthouly 1996. Kultur diinkubasi dalam kondisi gelap pada ± 25 o C. Kalus embriogenik disubkultur ke media 12 konsentrasi garam makro dan mikro MS, vitamin B5 yang dimodifikasi, sukrosa 30 g L -1 , phytagel 2,5 g L -1 dengan penambahan ZPT kinetin 9.γ0 μM. Perlakuan diulang sebanyak 10 kali, dimana setiap ulangan terdiri atas satu botol yang berisi satu klam kalus dengan berat masing-masing ± 200 mg. Kultur diinkubasi dalam ruangan gelap bersuhu 25°C. Embrio fase kotiledonari disubkultur ke media pendewasaan Etienne 2005. Kultur diinkubasi dalam kondisi terang pada ± 25 o C dengan intensits penyinaran 1000-1500 luks dan kelembaban relatif ± 60. Analisa Statistik dan Peubah yang Diamati Analisa statistik mengunakan rancangan acak lengkap 2 faktor dengan Faktor pertama ZPT dan yang kedua genotipe tanaman. Jika terdapat beda nyata antara perlakuan, akan dilakukan uji lanjut menggunakan Duncan pada taraf 5. Pengamatan dilakukan pada persentase pembentukan kalus dan berat basah kultur dalam media induksi kalus lanjutan, jumlah embrio somatik torpedo, jumlah kecambah, dan morfologi perkembangan embrio. Tahapan perkembangan embriogenesis somatik kopi Arabika dari mulai pembentukan kalus sampai kotiledonari diamati dengan menggunakan mikroskop. Tabel 8. Kombinasi perlakuan zat pengatur tumbuh 2,4-D dan 2-iP Perlakuan 2,4-D 2-iP 1 4.5β μM 4.9γ μM 2 4.5β μM 9.86 μM 3 4.5β μM 14,79 μM 4 4.5β μM 19.7β μM 5 4.5β μM β4.65 μM 6 9.04 μM 4.9γ μM 7 9.04 μM 9.86 μM 8 9.04 μM 14,79 μM 9 9.04 μM 19.7β μM 10 9.04 μM β4.65 μM