THE USE OF ETHYL METHANE SULPHONATE TO ENHANCE GENETIC DIVERSITY IN ARABICA COFFEE

104 Tabel 20. Primer SSR yang digunakan dalam mendeteksi mutan putatif kopi Arabika hasil mutasi menggunakan EMS. No Primer Sekuen Motif Produk bp 1 ssrR105 a F-CACCAATTCCACTGACAATG R-TCCCTGCCAACACACTTC GA18 187-222 2 ssrR209 a F-CGGGGGTAAAAAGATTGTAA R-TTGGTGGGAGGGGAGTA GA16 161-173 3 ssrR268 a F-GTATCCCACAATGAAATCAC R-AGTAGAATTTTCAACATATAAG GA19 131-147 4 ssrA8847 a F-GCACACATGAAAAAGATGCT R-GATGGACAGGAGTTGATGG GT18GA18 159-192 5 ssrCMA008 a F-CATTCTGGTCCTGATGCTCT R-TCATTCACTTATTAACGTCCATC CT14TG10 106-128 6 ssrCMA059 a F-GATGGACAGGAGTTGATGGT R-TTTTAACACTCATTTTGCCAAT CT9CA8 129-165 7 ssrCMA198 a F-AGCAACTCCAGTCCTCAGGT R-TGGAAGCCCGCATATAGTTT TG9AG18 195-236 8 SSR119699 a F-GCCGTGGTGGAAGATGTACT R-CGAGTTCACCAAGAACGTCA AT5 89-110 9 SSR123557 a F-ATCTCCTCGTTCTTCCCCAT R-GCTTGTAGCAGGCAGGAAAC CT4 206-270 10 ssrR175 a F-GCAGTGACGCAGCAATG R-AAAAGGAGAGCCAAAGCAGT GA20 214-217 11 M428 b F-GGGCACCAAAGAAAGTGG R-GATGTGAAATGCAAGCAGGA AC9 231 12 M329 b F-ACTCAGACAAACCCTTCAAC R-GATGTTTTGCATCTATTTGG GT10 235 13 M363 b F-GCATCTTCGTCTTCTTTGG R-GAAACGGGCCACTTGA AT6AC7 131 14 M358 b F-CATGCACTATTATGTTTGTGTTTT R-TCTCGTCATATTTACAGGTAGGTT CA11 248 15 M312 b F-TTGCGTAAAGAGAACGAGCA R-GTGTGGAAAATTCACCTGAGC TG9 106-150 16 M840 b F-GTCAGAGGCAACTGTAGGTTAATG R-CCAAATCCACTATTTCTTGGTTG AC19 196 17 CS c F-GCCGAATGCTCCTTACTTTC R-CAGGATACAGGGGAATGGGATC EST 110-170 18 ICL c F-GGCACAGCATCAAGAACCT R-ATCCAGTATCGCCATCAGC EST 300 19 ETR c F-GAGATGGTCCCTGCATGTTA R-TTGCTCGTCTTGAACCATAGC EST 370 20 GAL c F-CAGGAACCCAGGATTACA R-AGTTCTGCCCAACAGTCA EST 200 Sumber : a Teressa et al. 2010 b Priyono dan Samirat 2012 c Pazzopane et al.2012 Pelet DNA diberi etanol 70 sebanyak γ00 μL, disentrifugasi 1γ.000 rpm selama 5 menit, kemudian cairan dalam tabung dibuang. Pelet DNA dikeringkan menggunakan oven 50 o C selama 10-15 menit atau dibiarkan selama 12 jam, kemudian ditambahkan larutan buffer TE 50 μL. Setelah kualitas dan kuantitas ditentukan, DNA dianalisis dengan tehnik Polymerase Chain Reaction PCR. Komposisi bahan untuk reaksi PCR terdiri atas H 2 O, enzim taq polimerisasi, primer forward dan reverse, dan DNA. 105 Program reaksi amplifikasi dimulai dengan pre-denaturasi pada suhu 94 º C selama 4 menit, lalu dilakukan 35 siklus yang terdiri dari tahapan denaturasi pada suhu 94 º C selama 1 menit, penempelan primer annealing pada suhu 55º C selama 1 menit, pemanjangan primer elongation pada suhu 72º C selama 2 menit, dan diakhiri dengan 1 siklus reaksi pemanjangan primer pada suhu 72º C selama 7 menit. Hasil amplifikasi DNA kopi dipisahkan dengan tehnik elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid 8. Gel diwarnai dengan merendamnya dalam larutan Etidium bromida. Selanjutnya gel diamati dibawah sinar UV dengan perangkat Chemidoc gel system Biorad. Primer yang digunakan dalam mendeteksi ada tidaknya mutasi dapat dilihat pada Tabel 20. Hasil dan Pembahasan 1. Induksi Mutasi Menggunakan EMS pada Embrio Somatik Kopi Arabika Induksi mutasi dengan mutagen kimia EMS pada 5 perlakuan konsentrasi menunjukkan terjadinya penurun persentase kalus yang hidup. Kalus yang hidup adalah kalus yang tidak menunjukkan perubahan warna dari putih kuning menjadi coklat kehitaman. Penurunan persentase kalus yang hidup terendah adalah pada pemberian EMS konsentrasi 0.6 Gambar 38. Dua bulan dalam media induksi kalus bobot basah kalus juga menunjukkan pola yang sama, walaupun pada konsentrasi 0.2 terjadi kenaikan namun hasilnya tidak berbeda nyata dibandingkan perlakuan kontrol. Penekanan bobot basah terlihat nyata pada konsentrasi EMS 0.4, 0.6 dan 0.8. Gambar 39. Menurut van Harten 1998 penghambatan pertumbuhan ini akibat rusaknya ikatan atom pada molekul, sehingga terjadi penghambatan pertumbuhan sel tanaman. Penghambatan sel yang terlalu lama dapat menyebabkan aktifitas sel menjadi terhambat dan dapat mengakibatkan kematian sel. Gambar 38. Persentase penurunan jumlah kalus kopi Arabika yang hidup setelah diberi perlakuan EMS 106 Gambar 39. Rataan bobot basah kalus kopi Arabika hidup setelah diberi perlakuan EMS Gambar 40. Rataan jumlah torpedo kopi Arabika setelah diberi perlakuan EMS Dua bulan di media induksi kalus, kalus di subkultur ke media regenerasi. Empat bulan di media regenerasi jumlah torpedo yang dihasilkan juga menurun seiring dengan meningkatnya konsentrasi perendaman dengan EMS. Jumlah torpedo terendah dijumpai pada konsentrasi EMS 0.8 Gambar 40. Keragaan jumlah torpedo yang dihasilkan dapat dilihat pada Gambar 42. Dosis optimum dalam menghasilkan mutan terbanyak umumnya diperoleh disekitar dosis yang mematikan atau yang biasa disebut dosis lethal Datta 2001 untuk perlakuan mutasi dengan irradiasi dan konsentrasi lethal atau Lethal concentration LC untuk mutagen kimia. Hasil analisis LC 50 dari persentase kemampuan kalus kopi Arabika yang mampu beregenerasi, persamaan terbaik berbentuk kurva polinial dengan Y = 99.43 + 135.71 X – 732.14 X2+ 625 X3, dan nilai r = 0.99. Dari persamaan tersebut didapat LC 20 berada pada konsentrasi 0.38 , sementara LC 50 berada pada konsentrasi 0.65 atau diantara kisaran 0.6 dengan 0.8 Gambar 41. 107 Hasil LC 20 dan LC 50 kopi Arabika ini sejalan dengan persentase kalus yang hidup, bobot basah kalus dan jumlah torpedo yang dihasilkan, dimana penurunan secara nyata terjadi pada dosis 0.4. Semakin tinggi konsentrasi EMS yang diberikan semakin tinggi nilai LC untuk kemampuan kalus beregenerasi. Penurunan kemampuan dalam beregenerasi ini terjadi karena EMS dapat menyebabkan hambatan pada saat pembelahan sel sehingga sel tidak mampu beregenerasi. Pemberian EMS sebagai agen pengkelat dapat menyebabkan mutasi titik terkadang dapat mereduksi sifat fertilitas, menghambat jaringan dalam pembentukan tunas dan akhirnya akan mengalami kematian Sarker Biswas et al . 2002; Green et al. 2003. Gambar 41. Grafik persentase kalus kopi Arabika yang mampu beregenerasi pada beberapa konsentrasi EMS dengan lama perendaman 3 jam. Gambar 42. Keragaan jumlah torpedo kopi Arabika setelah diberi perlakuan EMS LC 20 = 0.38 LC 50 = 0.65 Y= 99.43 + 135.71 X – 732.14 X2+ 625 X3, r=0.99