Aklimatisasi Planlet Coffea arabika L. Hasil Embriogenesis Somatik

79 Gambar 27. Hasil amplifikasi sebagian DNA kopi Arabika varietas AS2K hasil embriogenesis somatik pada 10 primer yang diuji. A. Primer ssrR105 dan ssrR209. B. Primer ssrCMA059 dan Primer ssrR175. C. Primer ssrCMA008 dan Primer ssrR268. D. Primer ssrA8847 dan Primer SSR119699. E. Primer ssrCMA198 dan Primer SSR119699. Keterangan : L= Lader 100 bp; angka = nomor sampel yang diuji; T1=dan T2 tanaman sumber eksplan per masing-masing primer yang digunakan. A= Hasil amplifikasi primer yang pertama dari masing- masing gambar. B= Hasil amplifikasi primer yang pertama dari masing-masing gambar. A B C D E 80 Variasi somaklonal pada kopi dilaporkan semakin tinggi jika masa induksi kalus diperpanjang. Penelitian Etienne 2005 memperlihatkan bagaimana variasi somaklonal bertambah seiring dengan lamanya kultur suspensi yang dilakukan, dimana yang terrendah 1.3 pada kultur suspensi dengan lama 3 bulan dan meningkat secara nyata mencapai 6, 10, dan 25 pada tanaman dihasilkan dari suspensi berusia 6 , 9 dan 12 bulan. Perbanyakan kopi Arabika melalui embriogenesis somatik mempunyai peluang untuk menimbulkan variasi somaklonal, khususnya jika menggunakan kultur suspensi sel yang lama atau melakukan sub kultur kalus berulang. Pada penelitian ini tidak dilakukan sub kultur berulang maupun kultur suspensi yang lama sehingga dapat menekan terjadinya variasi somaklonal. Penelitian kedepan menjadi penting untuk mengamati karakter tanaman di rumah kaca dan di lapangan. Simpulan Konsentrasi ZPT berperan penting dalam proses embriogenesis tidak langsung. Media induksi embriogenesis somatik tergantung pada varietas yang digunakan. Media dengan penambahan 2,4-D 4.52 dan 2-iP 19.72 µM merupakan media terbaik dalam menginduksi embriogenesis somatik untuk varietas AS2K, sementara varietas S 795 dan Sigarar Utang pada media 2,4-D 4.52 dan 2-iP 14.79 µM. Penambahan BAP 17.76 µM menghasilkan persentase tertinggi 78 dengan jumlah embrio somatik sekunder terbanyak 6.92 dibandingkan ketiga perlakuan lainnya dalam menghasilkan embrio somatik sekunder. Penggunaan media tanam yang diberi arang sekam dan pupuk kandang dan pasir memberikan hasil terbaik dalam proses aklimatisasi. Hasil pengamatan molekuler pada sampel yang diuji memperlihatkan tidak adanya variasi somaklonal dari planlet yang dihasilkan. Media induksi kalus yang diberi ZPT 2,4-D 4.52 dan 2-iP 19.72 µM dapat digunakan dalam perbanyakan kopi Arabika. Penelitian menunjukkan protokol perbanyakan embrio somatik primer dan sekunder kopi Arabika telah diperoleh. Daftar Pustaka Ahmed W. Tileye Feyissa T, Disasa T. 2013. Somatic embryogenesis of a coffee Coffea arabica L. hybrid using leaf explants. Journal of Horticultural Science and Biotechnology . 88 4 469 –475 Al-Zahim MA, Ford-Lloyd BV, Newbury HJ. 1999. Detection of somaclonal variation in garlic Allium sativum L. using RAPD and cytological analysis. Plant Cell Rep .18: 473-477. Arimarsetiowati R. 2011. Pengaruh auksin 2,4-D dan sitokinin 2-iP terhadap pembentukan embriogenesis somatik langsung pada eksplan daun Coffea arabica L. Pelita Perkebunan. 272 : 68-77. Binawati DK. 2012. Pengaruh media tanam terhadap pertumbuhan Anggrek Bulan Phalaenopsis sp. Aklimatisasi Dalam Plenty. Wahana. 561: 60-68. Chen WH, Chen TM, Fu YM, Hsieh RM, Chen WS. 1998. Studies on somaclonal variation in Phalenopsis. Plant Cell Rep.18: 7-13. 81 Corredoira E, Valladares S, Vieitez AM. 2006. Morphohistological analysis of the origin and development of somatic embryos from leaves of mature Quercus robur . In Vitro Cell Dev Biol_Plant. 42:525-533. Etienne H, Bertrand. 2003. Somaclonal variation in Coffea arabica. Effects of genotype and embryogenic cell suspension age on frequency and phenotype of variants. Tree Physiology. 23: 419-426. Etienne H. 2005. Somatic Embryogenesis Protocol:Coffee Coffea arabica L. and Canephora p . In Jain SM, Gupta PK.eds. 2005. Protocol for Somatic Embryogenesis in Woody Plants. Printed in the Netherlands NL. Springer. hlm 167- 179. Fernández-Da Silva R, Hermoso-Gallardo L, Menéndez-Yuffá A. 2005. Primary and Secondary Somatic Embryogenesis In Leaf Sections and Cell Suspensions Of Coffea arabica Cv. Catimor. Intercia. 3011 : 694-698. Gatica AM, Arrieta G, Espinoza AM. 2008. Direct somatic embryogenesis in Coffea arabica L. cvs. Caturra and Catuaí: effect of triacontanol, light condition, and medium consistency. Agronomía Costarricense. 321: 139- 147. Geleta M, Herrera I, ArnulfoMonz, Bryngelsson T.2012. Genetic Diversity of Arabica Coffee Coffea arabica L. in Nicaragua as Estimated by Simple Sequence Repeat Markers. The Scientific World Journal, Article ID 939820, 2012:1-11. doi:10.11002012939820. George EF, Hall MA, De Klerk GJ. 2007. Plant Propagation by Tissue Culture. 3rd Edition: Vol. 1. The Background. Exegenetic Basingtone.UK.608 p. George EF. 1993. Plant Propagation by Tissue Culture: The Techlology. Edington 2nd.. Wits. England GB. Exegetics Ltd. Giridhar P, Kumar V, Indu EP, Ravishankar, Chandrasekar A. 2004. Thidiazuron induced somatic embryogenesis in Coffea arabica L. and Coffea canephora P ex Fr. Acta Botanica Croatica. 631: 25-33. Gunawan, L.W. 2007. Budidaya Anggrek. Jakarta ID. Penebar Swadaya. Kaeppler SM, Kaeppler HF, Rhee Y. 2000. Epigenetic aspects of somaclonal variation in plants. Plant Mol Biol 43:179-188. Karsinah, Sudarsono, Setyobudi L. Aswindinnoor. 2002. Keragaman Genetik Plasma Nutfah Jeruk Berdasarkan Analisis Penanda Molekuler RAPD. Jurnal Bioteknologi Pertanian . 71: 8-16. Kumar V, Madhava N, Ravishankar GA. 2006. Developments in coffee biotechnology-in vitro plant propagation and crop improvement. Plant Cell Tissue and Organ Culture . 87: 49-65. Neuenschwander B., Baumann TW. 1992. A novel type of somatic embryogenesis in Coffea arabica. Plant Cell Reports. 10 : 608-612. Noor NM, Clyde MM, Rao VR, Jeevamoney J. 2009. Radiosensitivity and in vitro studies of Citrus suhuiensis. In: IAEA. Induced Mutation in Tropical Fruit Trees. Vienna . hlm 17-32. Oktavia F, Siswanto, Budiani A, Sudarsono. 2003. Embriogenesis somatik langsung dan regenerasi planlet kopi Arabika Coffea arabica dari berbagai eksplan. Menara Perkebunan. 712 : 44-55. 82 Oktavia F. 2004. Induksi Embriogenesis Somatik dan Transformasi Gen Kitinase Ke Tanaman Kopi Coffea spp Dengan Bantuan Agrobacterium tumefaciens LBA44404. Bogor ID. Institut Pertanian Bogor. Orozco-Castillo C, Chalmers, KJ, Waugh R, Powel W. 1994. Detection of genetic diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD markers. Theoretical and Applied Genetics. 93:934-940. Perez G et al. 2011. Morfological and physiological characterization of two new pineapple somaclones derived from in vitro culture. In Vitro Cell Dev Biol_Plant . DOI 10.1007s11627-011-9342-y Podwyszyńska M. β005. Somaclonal variationin micropropagated tulips based on phenotype observation. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research. 13:109-122. Priyono. 1993. Embriogenesis somatik langsung pada kultur in vitro eksplan daun kopi Arabika Coffea arabica. Jurnal Pertanian Indonesia. 3l:16-20. Quiroz- Figueroa FR, Fuentes-Cerda CFJ, Rojas-Herrera R, Loyola-Vargas VM. 2002. Histological studies on the developmental stages and differentiation of two different somatic embryogenesis systems of Coffea arabica. Plant Cell Reports. 20:1141-1149. Rezende JC. Carvalho CHS. Santos ACR. Pasqual M. Teixeira JB. 2012. Multiplication of embryogenic calli in Coffea arabica L. Acta Scientiarum. 34 1 : 93-98. Samson NP, Campa C, Le Gal L, Noirot M, Thomas G, Lokeswari TS, Kochko A.de. 2006. Effect of primary culture medium composition on high frequency somatic embryogenesis in different Coffea species. Plant Cell Tissue and Organ Culture . 86:37-45. Somsri S, Jompook P, Kanhom P, Thayamanont P, Meecharoen S, Kumcha U. 2009. Development of seedless fruits mutants in citrus including tangerine C. reticulate and pummelo C. grandis through induced mutations and biotechnology. In: IAEA. Induced Mutation in Tropical Fruit Trees. Vienna. hlm 33-40. Soniya EV, Banerjee NS. Das MR. 2001. Genetic analysis of somaclonal variation among callus-derived plants of tomato. Current Science. 809:1213-1215. Srivastava LM. 2002. Plant Growth and Development. New York US. Academic Press. 772 p. Taji A, Kumar PP, Lakshmanan P. 2001. In vitro plant Breeding. Howarth press. Inc.UK.167 pages. van Boxtel J, Berthouly M. 1996. High frequency somatic embryogenesis from coffee leaves:factors influencing embryogenesis, and subsequent proliferation and regeneration in liquid medium. Plant Cell. Tissue Organ Culture . 44 1:. 7-17. Yeung EC. l995. Structural and development patterns in somatic embryogenesis. In: Thorpe TA ed In vitro embryogenesis in plants. Kluwer. Dordrecht. pp 205-247. Zhao Y, Grout BWW, Crisp P. 2005. Variation in morphology and disease susceptibility of micropropagated rhubarb Rheum rhaponticum PC49, compared to conventional plants. Plant Cell Tissue Organ Cult. 82:357-361. 83

6. EFISIENSI PENGGUNAAN SUKROSA DAN PHYTAGEL SERTA PELUANG PENGGUNAAN

TEMPORARY IMMERSION SYSTEM PADA PERBANYAKAN KOPI ARABIKA Abstrak Kultur in vitro memerlukan sukrosa sebagai sumber karbon dan agar untuk memadatkan media. Mahalnya harga sukrosa dan agar merupakan kendala tersendiri dalam perbanyakan tanaman menggunakan teknik embriogenesis somatik. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkaji kemungkinan penggunaan gula pasir dan agar komersial dalam embriogenesis somatik kopi Arabika. Penelitian tahap pertama menggunakan media dasar yang diberi kinetin 9.30 µM. Perlakuan yang diuji : sukrosa 35 g L -1 + phytagel 2.5 g L -1 , gula pasir 35 g L -1 + phytagel 2.5 g L -1 , dan gula pasir 2.5 g L -1 + agar komersial Swallow 9 g L -1 . Tahap kedua, embrio fase torpedo dipindahkan ke medium perkecambahan dengan media dasar yang diberi BAP 1.33 µM. Perlakuan yang diuji adalah media dengan sukrosa 40 g L -1 + phytagel 2.5 g L -1 , sukrosa 40 g L -1 + phytagel 1.5 g L -1 , gula pasir 40 g L -1 + phytagel 2.5 g L -1 , gula pasir 40 g L -1 + agar komersial 9 g L -1 . Tahap ketiga embrio fase torpedo dipindahkan ke dalam Temporary Immersion System merek RITA. Hasil penelitian tahap pertama memperlihatkan bahwa regenerasi kalus kopi Arabika mengalami penurunan yang nyata ketika menggunakan gula biasa dan agar komersial. Pada penelitian tahap kedua perkecambahan embrio tidak menunjukkan beda nyata ketika diberi gula pasir, baik pada phytagel 2.5 dan 1.5 g L -1 dan menunjukkan penurunan yang nyata ketika mengunakan agar komersial. Pemakaian RITA dengan penggunaan gula pasir tidak memberikan hasil yang berbeda nyata untuk semua karakter yang diamati. Kata kunci : Agar komersial, Coffea arabika L, embriogensis somatik, gula pasir, RITA 84

6. THE EFFICIENCY OF SUCROSE AND PHYTAGEL APPLICATION AND THE POTENCY OF TEMPORARY IMMERSION SYSTEM

USAGE FOR ARABICA COFFEE PROPAGATION Abstrak In vitro culture requires sucrose as carbon source and seaweed gel for condensing media. However, the price of sucrose and agar were quite expensive, causing difficulties in plant propagation using somatic embryogenesis technique. The purpose of this study was to examine the possibility to utilize sugar table and commercial agar in somatic embryogenesis of Arabica coffee. The first stage was testing basic media supplemented with kinetin 9.30 µM. Treatments tested were medium added with sucrose 35 g L -1 + Phytagel 2.5 g L -1 , sugar table 35 g L -1 + Phytagel 2.5 g L -1 , and sugar table 2.5 g L -1 + commercial agar powder Swallow 9 g L -1 . In the second one, the torpedo stage embryos were transferred into germination medium which was basic media added with BAP 1.33 µM. The treatments examined were germination medium basic media + BAP 1.33 µM combined with sucrose 40 g L -1 + Phytagel 2.5 g L -1 , sucrose 40 g L -1 + Phytagel 1.5 g L -1 , sugar table 40 g L -1 + Phytagel 2.5 g L -1 , sugar table 40 g L -1 + commercial agar 9 g L -1 . Furthermore, on the third stage, the torpedo stage embryos were transferred into Temporary Immersion System merck RITA. From the first stage, it revealed that the application of sugar table and commercial agar inhibited the regeneration of Arabica coffee callus. However, result from the second stage indicated that the application of sugar supplemented both with Phytagel 2.5 or 1.5 g L -1 gave no significant effect on embryo germination. However, the application of commercial agar significantly hampered embryo germination. The use of sugar table in RITA had no significant effect on all parameters observed. Keywords : Coffea arabika L, somatic embryogenesis, sugar table, commercial agar, RITA 85 Pendahuluan Kultur in vitro memerlukan nutrisi untuk pertumbuhan dan perkembangan sel, jaringan maupun organ. Komponen yang diperlukan tidak hanya unsur hara makro, hara mikro, dan vitamin saja, namun harus dilengkapi oleh sukrosa. Pemberian sukrosa dalam media kultur sangat diperlukan bagi pertumbuhan dan perkembangan biakan kultur in vitro. Sejumlah species tanaman pada kultur in vitro melalui aktivitas fotosintesis hanya mampu menyediakan karbohidrat dalam jumlah sedikit. Hal ini dikarenakan planlet yang dihasilkan bersifat autotropik George 1993; George et al. 2008. Sukrosa merupakan salah satu jenis karbon yang digunakan sebagai sumber energi dan telah digunakan dalam perbanyakan kultur in vitro untuk berbagai tujuan. Selain sebagai sumber energi, sukrosa juga berperan dalam senyawa osmotikum, pelindung stress, molekul sinyal pada tanaman Lipavska Konradora 2004; George et al. 2008, ploriferasi tunas dan daya hidup eksplan Priyakumari et al. 2002, serta pada species tanaman yang sulit diperbanyak secara in vitro dapat memaksimalkan aktivitas zat pengatur tumbuh Ramage Williams 2002. Pada kultur in vitro sukrosa pada umumnya diberikan dalam jumlah 2-5 Bridgen 1994; George et al. 2008, sementara dalam kultur kopi melalui embriogensis somatik, sukrosa diberikan pada kisaran 2-4 tergantung pada tahap perkembangan kultur Etienne 2005; Samson et al. 2006; Rezende et al. 2012. Selain sukrosa, jenis dan konsentrasi pemadat agar di dalam kultur in vitro dilaporkan berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan Cardoso et al. 2007. Keberadaan agar diperlukan untuk memadatkan media dengan tujuan supaya eksplan tetap bisa berada dipermukaan media. Konsentrasi agar yang diperlukan sangat tergantung dari jenis agar yang digunakan. Dalam kultur in vitro beberapa jenis pemadat yang biasa digunakan diantaranya adalah Agar, Bacto agar, Agarose, Gellan gum, dan Gelrite George et al. 2008. Peneliti terdahulu telah menggunakan berbagai jenis agar untuk kultur in vitro kopi. Rezende et al. 2012 menggunakan phytagel sebanyak 3.4 g L -1 pada kultur in vitro kopi. Etienne 2005 menggunakan phytagel 2.5 g L -1 untuk menginduksi kalus embriogenik kopi. Gatica-arias 2008 menggunakan Gelrite 2 g L -1 untuk perkecambahan biji, dan 2.5 g L -1 untuk induksi kalus dan perkembangan embrio. Rezende et al. 2012 menggunakan agar 5 g L -1 untuk induksi kalus dan perkembangan embrio kopi, sementara Fernandez-Da Silva et al. 2005 menggunakan agar 8 g L -1 dalam menginduksi embrio somatik primer dan sekunder kopi. Biaya komponen media yang tinggi sering menjadi kendala didalam perbanyakan kopi melaui embriogenesis somatik. Pembiayaan untuk pembelian bahan kimia yang tergantung dengan nilai tukar rupiah dan masa indent yang lama menjadi faktor pembatas yang terkadang sangat menyulitkan dalam proses kultur in vitro. Salah satu bahan kultur yang paling banyak diperlukan dalam pembuatan media adalah sukrosa. Sumber karbon seperti sukrosa berkontribusi sekitar 34 dari biaya produksi. Tidak hanya sukrosa, agar pemadat seperti phytagel juga dibutuhkan dalam jumlah yang tidak sedikit. Penggantian sukrosa menjadi gula pasir dan phytagel menjadi agar komersial diharapkan dapat menekan biaya dalam pembuatan media kultur. 86 Dalam perbanyakan massal disamping harga media, penggunaan alat tertentu untuk tujuan mempermudah penanganan kultur biasanya akan menjadi pertimbangan tersendiri. Di laboratorium ternama penggunaan Temporary Immersion System sudah diaplikasikan untuk perbanyakan kultur kopi, namum dalam aplikasinya belum ada yang menggunaan gula pasir. Pada penelitian terdahulu penggunaan beberapa bahan pemadat seperti phytagel, gelrite, gellan gum, dan agar telah digunakan dalam pementukan kalus dan perkembangan embrio kopi, sementara penggunaan gula pasir dan agar komersial Swallow untuk meminimalkan pengeluaran belanja kultur belum pernah dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkaji kemungkinan penggunaan gula pasir dan agar komersial dalam embriogenesis somatik kopi Arabika. Disamping penggunaan media padat, kemungkinan penggantian sukrosa menjadi gula pasir dalam media cair pada Temporary Immersion System merek RITA® juga dicobakan. Bahan dan Metoda Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, Unit Pengembangan Benih Unggul Pertanian, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian Indonesia. Penelitian berlangsung dari Mei 2013 sampai Mei 2015. Penelitian terdiri atas 3 kegiatan yaitu :

1. Respon kalus embriogenik terhadap penggunaan sukrosa dan phytagel

Kalus embriogenik disubkultur ke media MS 12 konsentrasi garam makro dan mikro, vitamin B5 yang dimodifikasi yang diberi penambahan zat pengatur tumbuh kinetin 9.30 µM. Perlakuan yang diuji adalah media dengan pemberian sukrosa 35 g L -1 dan phytagel 2.5 g L -1 , gula pasir 35 g L -1 dan phytagel 2.5 g L -1 , dan gula pasir 35 g L -1 dengan agar komersial Swallow 9 g L -1 . Perlakuan diulang sebanyak 10 kali, dimana setiap ulangan terdiri atas satu botol yang berisi klam kalus dengan berat masing-masing ± 0.2 g kalus, sehingga untuk masing- masing perlakuan dikulturkan sebanyak ± 5 g kalus. Kultur diinkubasi dalam ruangan gelap yang bersuhu 25 °C. Peubah yang diukur adalah berat kalus dan persen kalus yang membentuk embrio somatik. 2. Daya regenerasi efisiensi penggunaan sukrosa dan phytagel. Embrio fase torpedo dipindahkan ke medium perkecambahan yaitu 12 konsentrasi garam makro dan mikro MS, vitamin B5 yang dimodifikasi, zat pengatur tumbuh BAP 1.33 µM, sukrosa 40 g L -1 . Perkecambahan embrio dilakukan di bawah penyinaran lampu selama 16 jam dengan intensitas penyinaran 1000-1500 luks, pada suhu 25 o C dengan kelembaban relatif ± 60. Perlakuan yang diuji adalah media dengan pemberian sukrosa 40 g L -1 dan phytagel 2.5 g L -1 , sukrosa 40 g L -1 dan phytagel 1.5 g L -1 semi padat, gula pasir 40 g L -1 dan phytagel 2.5 g L -1 , gula pasir 40 g L -1 dengan agar komersial Swallow 9 g L -1 . 87 Perlakuan diulang sebanyak 10 kali, dimana setiap ulangan terdiri atas satu botol yang berisi sepuluh embrio somatik fase torpedo, sehingga untuk masing- masing perlakuan dikulturkan sebanyak 100 embrio somatik. Peubah yang diamati adalah jumlah torpedo, jumlah kecambah, jumlah planlet, tinggi planlet, jumlah daun, jumlah buku, jumlah akar dan panjang akar. Dua bulan setelah kultur, kecambah yang tumbuh kemudian disubkultur ke media yang sama. Perlakuan diulang sebanyak 20 kali. Satu botol terdiri dari satu kecambah. Peubah yang diamati adalah tinggi planlet, jumlah daun, jumlah buku, jumlah akar dan panjang akar.

3. Aplikasi penggunaan gula pasir dalam

Temporary Immersion System Embrio somatik fase torpedo dipindahkan ke dalam alat Temporary Immersion System merek RITA. Media perkecambahan yang digunakan adalah media MS dengan konsentrasi 12 garam makro dan mikro MS, vitamin B5 yg dimodifikasi, dan ZPT BAP 1.33 µM. Perlakuan yang diuji adalah penambahan sukrosa dan gula pasir sebanyak 40 g L - . Sebanyak 150 ml media dituangkan ke peralatan RITA. Media disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C selama 20 menit dengan tekanan 1.5 atm. Alat RITA diprogram untuk memompa media setiap 15 menit sekali dengan periode 4 jam. Setiap satu bulan sekali dilakukan sub kultur ke media yang sama. Perlakuan diulang sebanyak 3 kali. Masing- masing ulangan terdiri dari 30 torpedo. Sehingga dalam 1 ulangan ada 90 embrio fase torpedo. Perkecambahan embrio dilakukan dalam penyinaran selama 16 jam dengan intensitas penyinaran 1000-1500 luks pada suhu 25 o C dengan kelembaban relatif ± 60. Analisis Data Pada kegiatan satu dan dua, data yang diperoleh diuji secara statistik dengan metode racangan acak lengkap. Jika terdapat perbedaan yang nyata akan dilakukan uji lanjut mengunakan uji jarak dengan Duncan Multiple Range Test DMRT pada taraf uji 5. Pada kegiatan ketiga data diuji menggunakan T test. Hasil dan Pembahasan 1. Respon kalus embriogenik terhadap penggunaan sukrosa dan phytagel Tiga bulan dalam media regenerasi pemberian sukrosa 35 g L -1 dan gula pasir 35 g L -1 memberikan pengaruh terhadap berat kalus dalam proses regenerasi kalus embriogenik kopi Arabika. Hasil analisis statistik menunjukkan bobot kalus menurun secara nyata ketika media diberi perlakuan gula pasir 35 g L -1 , baik yang dikombinasikan dengan phytagel 2.5 g L -1 maupun dengan agar komersial 9 g L -1 . Berat terendah 0.74 g didapatkan pada perlakuan gula pasir 35 g L -1 + agar komersial 9 g L -1 . Penekanan terhadap panambahan bobot basah kalus kemungkinan besar dikarenakan adanya cemaran logam yang tergandung dalam gula pasir yang berdampak buruk terhadap pertumbuhan dan perkembangan kalus kopi Arabika.