97
Daftar Pustaka
Alabarrán J, Bertrand B, Lartaud M, Etienne H. 2005. Cycle characteristics in a temporary immersion bioreactor affect regeneration, morphology, water and
mineral status of coffee Coffea arabica somatic embryos. Plant. Plant Cell, Tissue and Organ Culture.
81:27-36. Bridgen MP.1994. A review of plant embrio culture. Hort. Sci. 29:1243-1245.
Cardoso MB, Bodanene-Zanettini MMH, De Mundstock E, Kaltchuk-Santos EK. 2007. Evaluation of Gelling Agents on Anther Culture: Response of Two
Soybean Cultivars. Braz. Arch. Biol.Tech. 506 : 933-939.
Etienne H. 2005. Somatic Embryogenesis Protocol:Coffee Coffea arabica L. and Canephora p
. In Jain SM, Gupta PK.eds. 2005. Protocol for Somatic Embryogenesis in Woody Plants.
Printed in the Netherlands NL. pp 167- 179.
Etienne H, Dechamp E, Barry-Etienne D, Bertrand B. 2006. Bioreactors in coffee micropropagation. Braz. J. Plant. Physiol. 18:45-54.
Fernández-Da Silva R, Hermoso-Gallardo L, Menéndez-Yuffá A. 2005. Primary and Secondary Somatic Embryogenesis In Leaf Sections and Cell
Suspensions Of Coffea arabica Cv. Catimor. Intercia. 3011 : 694-698. Gatica-Arias AM, Arrieta-Espinoza G, Esquivel AME. 2008. Plant regeneration
via indirect somatic embryogenesis and optimisation of genetic transformation in Coffea arabica L. cvs. Caturra and Catuaí. Electronic
Journal of
Biotechnology. 111:1-12. Issue of January 15.
http:www.ejbiotechnology.infocontentvol11issue1full9 . Diakses 10
Mei 2012. George EF, Hall MA, De Klerk GJ. 2008. The Components of Plant Tissue
Culture Media I: Macro-and Micro_Nutrrients pp: 65-113 In. George EF,
Hall MA, De Klerk GJ Eds. Plant Propagation by Tissue Culture: The Background. Vol: 1.3rd. Netherlands NL.Edition Spriger.
George EF. 1993. Plant Propagation by Tissue Culture: The Techlology. 2nd. Exegetics Ltd.Edington. Wetsburry.Wits.England. p 181
Hapsari BW, Ermayanti TM, Rantau DE, Rudiyanto. 2011. Comparison of the Reduction Effect of Sucrose and Table Sugar Concentration on Growth
Characteristics of Red Ginger Zingiber officinale Rocs. Cultured in Liquid Medium. Annales Bogorienses. 15 1 : 15-20.
Lipavska H, Konradova H. 2004. Somatic embryogenesis in conifers: the role of carbohydrate metabolism. In Vitro Cell.Biol-Plant. 40:23-30.
McAlister B, Finnie J, Watt MP, Blakeway F. 2005. Use of the temporary immersion bioreactor system RITA® for production of commercial
Eucalyptus clones in Mondi Forests SA. Plant Cell, Tissue and Organ Culture.
813: 347-358. Ogero KO, Gitonga NM, Mwangi M, Ombori O, Ngugi M. 2012. Cost-effective
nutrient sources for tissue culture of cassava Manihot esculenta Crantz. African Journal of Biotechnology
. 1166 : 12964-12973. Available online at
http:www.academicjournals.orgAJB . DOI: 10.5897AJB12.579. ISSN
1684 –5315 ©2012 Academic Journals.
98
Priadi D, Fitriani H, Sudarmonowati E. 2008. Pertumbuhan In vitro Tunas Ubi Kayu Manihot esculenta Crantz pada Berbagai Bahan Pemadat Alternatif
Pengganti Agar. Biodiversitas. 9 1 : 9-12. ISSN: 1412-033X Priyakumari I, Sheela VL. George S, Misra RL. 2002. Effect of carbon sources on
In vitro Shoot proliferation and rooting of gladiolus. Floriculture Research Trend in India. Proceedings of the National Symposium on Indian Flori
culture in new millennium. Lal-Bagh. Bangalore IN. Feb. 2002.
Rajavel L, Stephan R. 2014. Low Cost In Vitro Propagation of Tylophora indica Burm f. Merrill. using different Carbon Sources. Journal of Academia and
Industrial Research . 3 5 : 221-224.
Ramage CM, Williams RR. 2002. Mineral Nutrition and Plant marphogenesis. In Vitro Cell. Biol-Plant.
38;116-124. Rezende JC. Carvalho CHS. Santos ACR. Pasqual M. Teixeira JB. 2012.
Multiplication of embryogenic calli in Coffea arabica L. Acta Scientiarum. 34 1 : 93-98.
Saji KV, Sujatha M. 1998. Embryogenesis and plant regeneration in anther culture of sunflower Helianthus anuus L.. Euphytica 103: 1-7.
Samson NP, Campa C, Le Gal L, Noirot M, Thomas G, Lokeswari TS, Kochko A.de. 2006. Effect of primary culture medium composition on high
frequency somatic embryogenesis in different Coffea species. Plant Cell Tissue and Organ Culture
. 86:37-45. Scheidt GN, Arakaki H, Chimilovski AS, Portella ACF, Spier MR,
Woiciechowski AL, Biasi, LA, Soccol CR. 2009. Utilization of the Bioreactor of Immersion by Bubbles at the Micropropagation of Ananas
comosus . Braz. Arch. Biol. Technol. 52l:37-43.
Sharma V, Singh I, Sharma S. 2013. Formulation of Medium with Low Cost Options for in Vitro Caulogenesis in Ethnomedicinal Herb Stevia
Rebaudiana. Dama International. Trenda in Biotechnology Research. 2 1 2013 : 36-10. ISSN 2320
–0421Print; ISSN 2320–043X Online. [SNI] Standar Nasional Indonesia. 2010. Gula kristal-Bagian 3. Putih: Badan
Standarisai Nasional. SNI 3140.3.2010. hal 1-18 Swamy MK, Sudipta KM, Balasubramanya S, Anuradha M. 2010. Effect of
Different Carbon Sources on In Vitro Morphogenetic Response of Patchouli Pogostemon Cablin Benth.. Journal of Phytology. 28: 11
–17. Teixeira Da Silva JA. 2015. Response of Syngonium podophyllum
L. „White Butterfly‟ shoot cultures to alternative media additives and gelling agents,
and flow cytometric analysis of regenerants. Nusantara Biosc Ienc. 71 : 26-32. May 2015 DOI: 10.13057nusbioscin070105. E-ISSN: 2087-3956
Thorpe TA, Joy IV RW, Leung MW. 1986. Starch turnover in shoot-forming tobacco callus. Physiol. Plant 66: 58-62.
Yang L, Zambrano Y, Hu C-J, Carmona ER, Bernal A, Pérez A, Zayas CM, Li Y- R, Guerra A, Santana I, Arencibia A. 2010. Sugarcane metabolites produced
in CO2-rich temporary immersion bioreactors TIBs induce tomato Solanum lycopersicum resistance against bacterial wilt Ralstonia
solanacearum
. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 46:558-568.
99
7.
PENINGKATAN KERAGAMAN GENETIK KOPI ARABIKA DENGAN ETHYL METHAN SULFONAT
Abstrak
Kopi Arabika merupakan tanaman tahunan yang menyerbuk sendiri, sehingga tampa adanya proses pemuliaan, populasi tanaman umumnya relatif
seragam. Meningkatkan keragaman genetik kopi Arabika dapat dilakukan dengan mengunakan induksi mutasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji
kemungkinan pengunaan EMS dalam kultur in vitro untuk meningkatkan keragaman genetik kopi Arabika. Kalus varietas AS2K digunakan sebagai materi
yang dimutasi. Mutasi dilakukan cara merendam kalus pada konsentrasi EMS 0.0 ; 0.2 ; 0.4 ; 0.6 dan 0.8 selama 3 jam. Peubah yang diamati adalah persentase
kalus hidup, bobot kalus, jumlah embrio somatik, dan jumlah kecambah yang dihasilkan, dan analisis molekuler menggunakan SSR. Hasil analisis statistik
menunjukkan bahwa terjadi penurunan jumlah persentase kalus yang hidup, bobot kalus, jumlah torpedo dan jumlah kecambah yang dihasilkan, seiring dengan
meningkatnya konsentrasi EMS yang dberikan. Penurunan secara nyata terlihat ketika konsentrasi EMS 0.4. Lethal concentration 20 kalus kopi Arabika yang
mampu bergenerasi berada pada konsentrasi 0.38, dan LC 50 pada konsentrasi 0.65. Hasil molekuler dari marka SSR menunjukkan bahwa terjadi perubahan
pola pita dari planlet yang diberi perlakuan EMS 0.2 dan 0.8, pada ssr CMA 198, ssr M312 dan satu primer EST CS.
Kata kunci : Coffea arabica L., kalus, induksi mutasi, lethal concentration, SSR
100
7. THE USE OF ETHYL METHANE SULPHONATE TO ENHANCE GENETIC DIVERSITY IN ARABICA COFFEE
Abstract
Arabica coffee is self-pollinated annual plant, hence without breeding intervention will generate uniform population. To increase genetic diversity of Arabica coffee
can be done using mutation induction. This study aimed to assess the possibility of EMS usage in in vitro culture to enhance genetic diversity of Arabica coffee.
Callus of AS2K genotype was used as a mutated material. Mutation was performed by submersing callus in some EMS concentration 0.0, 0.2, 0.4, 0.6 and
0.8
for 3 hours. Parameters measured were percentage of living callus, callus weight, number of somatic embryos, number of germinated embryos and
molecular analysis using SSR. The result revealed there was decrease in percentage of living callus, callus weight, number of torpedo embryos and the
number of germinate embryos with the increase of EMS concentration. Significant decrease of all parameters was shown at 0.4 EMS concentration.
The Lethal Concentration 20 LC 20 of Arabica coffee callus capable to regenerate was on EMS 0.38, while LC 50 was 0.65 EMS, soaking for 3
hours.
The result of SSR analysis indicated changes in band pattern of plantlets treated with EMS at 0.2 dan 0.8 concentration at primary ssr CMA 198, ssr
M312 and one of EST CS primary. Keywords : Coffea arabica
L. Calli, Mutation induction, lethal concentration,
SSR
101
Pendahuluan
Perakitan varietas unggul baru untuk mendapatkan sifat tertentu seringkali memerlukan adanya populasi tanaman dengan keragaman genetik yang tinggi.
Kopi Arabika merupakan tanaman tahunan yang menyerbuk sendiri, sehingga tampa adanya proses pemuliaan, populasi tanaman umumnya relatif seragam,
sehingga terkadang sulit untuk mendapatkan tetua untuk bahan persilangan.
Keragaman genetik secara konvensional dapat terjadi karena segregasi, rekombinasi atau mutasi alami. Mutasi alami terjadi secara spontan, sering sekali
dikaitkan dengan faktor lingkungan. Mutasi ini terjadi secara lambat dan terus- menerus, sehingga memerlukan waktu yang lama untuk mengakumulasi mutan
dalam populasi alami Damayanti 2002.
Secara non konvensional, keragaman genetik juga dapat diinduksi melalui variasi somaklonal, perlakuan mutasi fisik dan kimia, fusi protoplas dan
rekayasa genetika. Induksi mutasi adalah salah satu cara untuk meningkatkan keragaman genetik untuk melengkapi pemuliaan tanaman Odeigah et al. 1998.
Mutasi buatan telah memberikan kontribusi nyata terhadap perbaikan tanaman di dunia Maluszynski et al. 1995.
Mutagen yang berasal dari bahan kimia telah lama dicobakan untuk meningkatkan keragaman genetik tanaman, salah satunya adalah Ethyl Methane
Sulfonate EMS. Penggunaan EMS telah berhasil menginduksi pembentukan
mutan pada tanaman tembakau Gichner 2003, kubis-kubisan Sakamoto et al. 2002; Spasibionek 2006, pisang Roux 2004, kenaf Arumingtyas Indriyani
2005, apokat Yenisbar 2005 dan abaka Purwati 2007.
Ethyl Methane Sulfonate merupakan mutagen kimia yang paling banyak
digunakan karena toksitasnya tidak terlalu tinggi moderat toxic, memiliki efektifitas yang tinggi untuk menginduksi banyak mutasi multiple mutation per
genom, biasanya mutasinya berupa subsitusi satu basa, harganya relatif lebih murah dibandingkan mutagen kimia lainnya, tersedia dipasaran, dan tidak
meninggalkan racun setelah dihidrolisat. Ethyl Methane Sulfonate juga dilaporkan dapat mengubah lokus tertentu tanpa menginduksi sejumlah besar mutasi yang
terpaut dekat dengan lokus tersebut sehingga sangat berguna bagi proses pemuliaan tanaman van Harten 1998; von Arnim 2005.
Bila dibandingkan dengan metode pemuliaan mutasi secara in vivo, penggunaan metode in vitro memerlukan waktu yang lebih singkat untuk
menghasilkan suatu varietas baru. Pada tahun pertama setelah perlakuan mutagen akan diperoleh keragaman genetik di antara tanaman mutan di laboratorium,
sedangkan tahun kedua sampai ketujuh uji kestabilan genetik tanaman termutasi di rumah kaca dan lapangan, dan tahun kedelapan dapat melepas klon mutan.
Keuntungan metode in vitro, isolasi jaringan termutasi akan lebih mudah dilakukan dengan cara multiplikasi tunas Donini et al. 1991.
Program mutagenesis menurut Jain 2010 tergantung pada pemantapan prosedur regenerasi tanaman, optimasi perlakuan mutagen, dan evisiensi skrining
populasi tanaman varian untuk mendapatkan mutan yang diinginkan. Mendapatkan prosedur regenerasi dari kalus yang telah diberi perlakuan mutasi,
hanya dapat dilakukan apabila sistem regenerasi embriogenesis somatik telah dikuasai dengan baik, demikian juga apabila ingin mengoptimasi perlakuan
mutagen yang akan digunakan.
102
Faktor kunci dalam melakukan induksi mutasi adalah penentuan dosis iradiasi atau konsentrasi bahan mutagen yang akan digunakan yang merupakan
jumlah energi iradiasi atau banyaknya mutagen yang diabsorbsi oleh jaringan tanaman Gaul 1977; Ahloowalia Maluszynski, 2001. Sensitifitas terhadap
mutagen dapat di ukur berdasarkan nilai LC lethal concentration yaitu konsentrasi yang menyebabkan kematian dari populasi tanaman yang di mutasi.
Beberapa penelitian memperlihatkan bahwa variabilitas mutan tertinggi dalam menginduksi mutasi menggunakan mutagen kimia disekitar LC 20 - LC 50. Nilai
LC 20 dan LC 50 akan berbeda-beda pada setiap genotipe tanaman. Selain menentukan kadar sensitifitas nilai LC 50 dapat digunakan untuk menghitung
perkiraan konsentrasi dan waktu optimal yang diperlukan dalam menginduksi mutan Abdullah et al. 2009.
Marka DNA memberikan alternatif terbaik dalam menganalisis keragaman genetik tanaman karena mampu memberikan polimorfik pita DNA dalam jumlah
banyak, konsisten, tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan tidak ada efek pleiotropi Brar 2002. Marka molekuler dapat diturunkan dan berasosiasi dengan
genotip tertentu Asiedu et al. 1989, keterpautan dengan karakter yang diinginkan McCaskill Giovannoni 2002, dan pewarisannya mengikuti hukum
mendel dan pewarisannya stabil Brar 2002.
Penggunaan marka molekuler SSR dalam mengetahui keragaman genetik tanaman telah dilaporkan pada beberapa tanaman penting seperti pada padi
Chakravarthi Naravaneni 2006, barley Becker Heun 1995, gandum Prasad et al. 2000, dan vanili Bory et al. 2008. Pada tanaman kopi selain telah
digunakan untuk mengetahui keragaman genetik hasil persilangan
Bhat et al.
2005 juga dipakai untuk membedakan antara tanaman diploid dan tetrapoid Moncada McCouch 2004.
Pembentukan mutan melalui proses induksi mutasi menggunakan EMS pada pemuliaan kopi Arabika belum pernah dilaporkan. Berdasarkan hal tersebut maka
penelitian ini bertujuan untuk melihat seberapa besar peluang untuk mendapatkan mutan putatif kopi Arabika dengan menggunakan EMS, dan mengevaluasi
keragaman morfologi dan genetik yang dihasilkan dengan menggunakan marka molekular SSR. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi awal
tentang keberadaan mutan baru yang dapat digunakan dalam perbaikan sifat tanaman kopi Arabika.
Bahan dan metoda
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, Unit Pengembangan Benih Unggul Pertanian, Badan Penelitian dan Pengembangan
Pertanian Indonesia, Laboratorium Morfologi Anatomi dan Sitologi Tumbuhan, Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Laboratorium
Biologi Melekular, Balai Besar Sumber Daya Genetik Tanaman dan laboratorium Biologi Molekuler Tanaman Departemen Agronomi dan Hortikultura, Institut
Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung dari Juni 2012 sampai April 2015.
Penelitian ini terdiri dari 2 kegiatan yaitu : Induksi Mutasi Menggunakan EMS Pada Embrio Somatik Kopi Arabika,dan Evalusasi Keragaman Genetik
putatif Mutan Planlet Kopi Asal Embrio Somatik.
103
1. Induksi Mutasi Menggunakan EMS pada Embrio Somatik Kopi Arabika
-
Bahan tanaman Daun muda yang sudah membuka sempuna dari tanaman Kopi Arabika
Coffea arabica varietas AS2K digunakan sebagi eksplan. Dipilihnya varietas ini karena mempunyai respon terbaik dalam menghasilkan jumlah embrio somatik
pada penelitian sebelumnya, dan merupakan varietas yang lebih tahan terhadap penyakit karat.
-
Pelaksanaan Percobaan Kalus embriogenik yang terbentuk dari perlakuan induksi kalus diisolasi
dan dikumpulkan di petridist. Kalus seberat dengan 2000 mg direndam dalam EMS 0.0 ; 0.2 ; 0.4; 0.6 dan 0.8 vv. Sebagai kontrol kalus embriogenik
yang tidak direndam dalam EMS EMS 0.0 .
Untuk melarutkan EMS digunakan larutkan dimetil sulfonat DMSO 4 vv. Sebelum digunakan larutan EMS disterillisasi menggunakan filter millipore
ukuran 0.2 µM. Kalus yang direndam EMS selama 3 jam, kemudian dibilas 3 kali dengan aquades steril. Kalus yang telah direndam mutagen EMS dan kontrol
dikulturkan dalam media induksi embrio. Kultur diinkubasikan dalam ruang gelap bersuhu ± 25
o
C. Embrio somatik yang terbentuk kemudian dipindahkan ke media perkecambahan.
Media diinkubasi dalam ruang kultur bersuhu ± 25
o
C dengan penyinaran 1000 lux menggunakan lampu TL selama 16 jam. LD 20 dan LD50 ditentukan
menggunakan curve fit analysis dengan menghitung jumlah kalus yang mampu beregenerasi. Parameter yang diamati adalah bobot basah kalus, jumlah torpedo,
jumah kecambah dan jumlah planlet yang dihasilkan.
5.
Evaluasi Keragaman Genetik Putatif Mutan Planlet Kopi Arabika
-
Bahan tanaman Daun kopi Arabika varietas AS2K dari planlet hasil mutasi dari beberapa
konsentrasi EMS diambil untuk diuji dan akan dilihat seberapa besar variasi yang dihasilkan. Daun dari planlet yang tidak diberi EMS dijadikan sebagai tanaman
kontrol.
-
Pelaksanaan percobaan Daun ditimbang ± 2 g, lalu diekstraksi menggunakan CTAB Cetyl
Trimethyl Ammonium Bromide metode Orozco-Castillo et al. 1994 yang telah
dimodifikasi. Sebanyak 700 µl larutan bufer ekstraksi, mercapto ethanol 0.1 dan PVPP 1 ditambahkan ke dalam hasil gerusan, dan diingkubasi selama 1 jam
pada suhu 65 C. Selanjutnya ditambahkan 500 µl kloroform dan isoamil alkohol
24:1, dicampur secara homogen dan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit. Setelah disentrifugasi, supernatan larutan sebelah atas
dipindahkan ke tabung mikro baru dan ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 500 µl, diikuti dengan penambahan sodium asetat 3M pH 5.2 sebanyak 50 µl.
Larutan supernatan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit.
104
Tabel 20. Primer SSR yang digunakan dalam mendeteksi mutan putatif kopi Arabika hasil mutasi menggunakan EMS.
No Primer
Sekuen Motif
Produk bp
1 ssrR105
a
F-CACCAATTCCACTGACAATG R-TCCCTGCCAACACACTTC
GA18 187-222
2 ssrR209
a
F-CGGGGGTAAAAAGATTGTAA R-TTGGTGGGAGGGGAGTA
GA16 161-173
3 ssrR268
a
F-GTATCCCACAATGAAATCAC R-AGTAGAATTTTCAACATATAAG
GA19 131-147
4 ssrA8847
a
F-GCACACATGAAAAAGATGCT R-GATGGACAGGAGTTGATGG
GT18GA18 159-192
5 ssrCMA008
a
F-CATTCTGGTCCTGATGCTCT R-TCATTCACTTATTAACGTCCATC
CT14TG10 106-128
6 ssrCMA059
a
F-GATGGACAGGAGTTGATGGT R-TTTTAACACTCATTTTGCCAAT
CT9CA8 129-165
7 ssrCMA198
a
F-AGCAACTCCAGTCCTCAGGT R-TGGAAGCCCGCATATAGTTT
TG9AG18 195-236
8 SSR119699
a
F-GCCGTGGTGGAAGATGTACT R-CGAGTTCACCAAGAACGTCA
AT5 89-110
9 SSR123557
a
F-ATCTCCTCGTTCTTCCCCAT R-GCTTGTAGCAGGCAGGAAAC
CT4 206-270
10 ssrR175
a
F-GCAGTGACGCAGCAATG R-AAAAGGAGAGCCAAAGCAGT
GA20 214-217
11 M428
b
F-GGGCACCAAAGAAAGTGG R-GATGTGAAATGCAAGCAGGA
AC9 231
12 M329
b
F-ACTCAGACAAACCCTTCAAC R-GATGTTTTGCATCTATTTGG
GT10 235
13 M363
b
F-GCATCTTCGTCTTCTTTGG R-GAAACGGGCCACTTGA
AT6AC7 131
14 M358
b
F-CATGCACTATTATGTTTGTGTTTT R-TCTCGTCATATTTACAGGTAGGTT
CA11 248
15 M312
b
F-TTGCGTAAAGAGAACGAGCA R-GTGTGGAAAATTCACCTGAGC
TG9 106-150
16 M840
b
F-GTCAGAGGCAACTGTAGGTTAATG R-CCAAATCCACTATTTCTTGGTTG
AC19 196
17 CS
c
F-GCCGAATGCTCCTTACTTTC R-CAGGATACAGGGGAATGGGATC
EST 110-170
18 ICL
c
F-GGCACAGCATCAAGAACCT R-ATCCAGTATCGCCATCAGC
EST 300
19 ETR
c
F-GAGATGGTCCCTGCATGTTA R-TTGCTCGTCTTGAACCATAGC
EST 370
20 GAL
c
F-CAGGAACCCAGGATTACA R-AGTTCTGCCCAACAGTCA
EST 200
Sumber :
a
Teressa et al. 2010
b
Priyono dan Samirat 2012
c
Pazzopane et al.2012 Pelet DNA diberi etanol 70 sebanyak
γ00 μL, disentrifugasi 1γ.000 rpm selama 5 menit, kemudian cairan dalam tabung dibuang. Pelet DNA dikeringkan
menggunakan oven 50
o
C selama 10-15 menit atau dibiarkan selama 12 jam, kemudian
ditambahkan larutan buffer TE 50 μL. Setelah kualitas dan kuantitas ditentukan, DNA dianalisis dengan tehnik Polymerase Chain Reaction PCR.
Komposisi bahan untuk reaksi PCR terdiri atas H
2
O, enzim taq polimerisasi, primer forward
dan reverse, dan DNA.