Aplikasi penggunaan gula pasir dalam

97 Daftar Pustaka Alabarrán J, Bertrand B, Lartaud M, Etienne H. 2005. Cycle characteristics in a temporary immersion bioreactor affect regeneration, morphology, water and mineral status of coffee Coffea arabica somatic embryos. Plant. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81:27-36. Bridgen MP.1994. A review of plant embrio culture. Hort. Sci. 29:1243-1245. Cardoso MB, Bodanene-Zanettini MMH, De Mundstock E, Kaltchuk-Santos EK. 2007. Evaluation of Gelling Agents on Anther Culture: Response of Two Soybean Cultivars. Braz. Arch. Biol.Tech. 506 : 933-939. Etienne H. 2005. Somatic Embryogenesis Protocol:Coffee Coffea arabica L. and Canephora p . In Jain SM, Gupta PK.eds. 2005. Protocol for Somatic Embryogenesis in Woody Plants. Printed in the Netherlands NL. pp 167- 179. Etienne H, Dechamp E, Barry-Etienne D, Bertrand B. 2006. Bioreactors in coffee micropropagation. Braz. J. Plant. Physiol. 18:45-54. Fernández-Da Silva R, Hermoso-Gallardo L, Menéndez-Yuffá A. 2005. Primary and Secondary Somatic Embryogenesis In Leaf Sections and Cell Suspensions Of Coffea arabica Cv. Catimor. Intercia. 3011 : 694-698. Gatica-Arias AM, Arrieta-Espinoza G, Esquivel AME. 2008. Plant regeneration via indirect somatic embryogenesis and optimisation of genetic transformation in Coffea arabica L. cvs. Caturra and Catuaí. Electronic Journal of Biotechnology. 111:1-12. Issue of January 15. http:www.ejbiotechnology.infocontentvol11issue1full9 . Diakses 10 Mei 2012. George EF, Hall MA, De Klerk GJ. 2008. The Components of Plant Tissue Culture Media I: Macro-and Micro_Nutrrients pp: 65-113 In. George EF, Hall MA, De Klerk GJ Eds. Plant Propagation by Tissue Culture: The Background. Vol: 1.3rd. Netherlands NL.Edition Spriger. George EF. 1993. Plant Propagation by Tissue Culture: The Techlology. 2nd. Exegetics Ltd.Edington. Wetsburry.Wits.England. p 181 Hapsari BW, Ermayanti TM, Rantau DE, Rudiyanto. 2011. Comparison of the Reduction Effect of Sucrose and Table Sugar Concentration on Growth Characteristics of Red Ginger Zingiber officinale Rocs. Cultured in Liquid Medium. Annales Bogorienses. 15 1 : 15-20. Lipavska H, Konradova H. 2004. Somatic embryogenesis in conifers: the role of carbohydrate metabolism. In Vitro Cell.Biol-Plant. 40:23-30. McAlister B, Finnie J, Watt MP, Blakeway F. 2005. Use of the temporary immersion bioreactor system RITA® for production of commercial Eucalyptus clones in Mondi Forests SA. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 813: 347-358. Ogero KO, Gitonga NM, Mwangi M, Ombori O, Ngugi M. 2012. Cost-effective nutrient sources for tissue culture of cassava Manihot esculenta Crantz. African Journal of Biotechnology . 1166 : 12964-12973. Available online at http:www.academicjournals.orgAJB . DOI: 10.5897AJB12.579. ISSN 1684 –5315 ©2012 Academic Journals. 98 Priadi D, Fitriani H, Sudarmonowati E. 2008. Pertumbuhan In vitro Tunas Ubi Kayu Manihot esculenta Crantz pada Berbagai Bahan Pemadat Alternatif Pengganti Agar. Biodiversitas. 9 1 : 9-12. ISSN: 1412-033X Priyakumari I, Sheela VL. George S, Misra RL. 2002. Effect of carbon sources on In vitro Shoot proliferation and rooting of gladiolus. Floriculture Research Trend in India. Proceedings of the National Symposium on Indian Flori culture in new millennium. Lal-Bagh. Bangalore IN. Feb. 2002. Rajavel L, Stephan R. 2014. Low Cost In Vitro Propagation of Tylophora indica Burm f. Merrill. using different Carbon Sources. Journal of Academia and Industrial Research . 3 5 : 221-224. Ramage CM, Williams RR. 2002. Mineral Nutrition and Plant marphogenesis. In Vitro Cell. Biol-Plant. 38;116-124. Rezende JC. Carvalho CHS. Santos ACR. Pasqual M. Teixeira JB. 2012. Multiplication of embryogenic calli in Coffea arabica L. Acta Scientiarum. 34 1 : 93-98. Saji KV, Sujatha M. 1998. Embryogenesis and plant regeneration in anther culture of sunflower Helianthus anuus L.. Euphytica 103: 1-7. Samson NP, Campa C, Le Gal L, Noirot M, Thomas G, Lokeswari TS, Kochko A.de. 2006. Effect of primary culture medium composition on high frequency somatic embryogenesis in different Coffea species. Plant Cell Tissue and Organ Culture . 86:37-45. Scheidt GN, Arakaki H, Chimilovski AS, Portella ACF, Spier MR, Woiciechowski AL, Biasi, LA, Soccol CR. 2009. Utilization of the Bioreactor of Immersion by Bubbles at the Micropropagation of Ananas comosus . Braz. Arch. Biol. Technol. 52l:37-43. Sharma V, Singh I, Sharma S. 2013. Formulation of Medium with Low Cost Options for in Vitro Caulogenesis in Ethnomedicinal Herb Stevia Rebaudiana. Dama International. Trenda in Biotechnology Research. 2 1 2013 : 36-10. ISSN 2320 –0421Print; ISSN 2320–043X Online. [SNI] Standar Nasional Indonesia. 2010. Gula kristal-Bagian 3. Putih: Badan Standarisai Nasional. SNI 3140.3.2010. hal 1-18 Swamy MK, Sudipta KM, Balasubramanya S, Anuradha M. 2010. Effect of Different Carbon Sources on In Vitro Morphogenetic Response of Patchouli Pogostemon Cablin Benth.. Journal of Phytology. 28: 11 –17. Teixeira Da Silva JA. 2015. Response of Syngonium podophyllum L. „White Butterfly‟ shoot cultures to alternative media additives and gelling agents, and flow cytometric analysis of regenerants. Nusantara Biosc Ienc. 71 : 26-32. May 2015 DOI: 10.13057nusbioscin070105. E-ISSN: 2087-3956 Thorpe TA, Joy IV RW, Leung MW. 1986. Starch turnover in shoot-forming tobacco callus. Physiol. Plant 66: 58-62. Yang L, Zambrano Y, Hu C-J, Carmona ER, Bernal A, Pérez A, Zayas CM, Li Y- R, Guerra A, Santana I, Arencibia A. 2010. Sugarcane metabolites produced in CO2-rich temporary immersion bioreactors TIBs induce tomato Solanum lycopersicum resistance against bacterial wilt Ralstonia solanacearum . In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 46:558-568. 99 7. PENINGKATAN KERAGAMAN GENETIK KOPI ARABIKA DENGAN ETHYL METHAN SULFONAT Abstrak Kopi Arabika merupakan tanaman tahunan yang menyerbuk sendiri, sehingga tampa adanya proses pemuliaan, populasi tanaman umumnya relatif seragam. Meningkatkan keragaman genetik kopi Arabika dapat dilakukan dengan mengunakan induksi mutasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji kemungkinan pengunaan EMS dalam kultur in vitro untuk meningkatkan keragaman genetik kopi Arabika. Kalus varietas AS2K digunakan sebagai materi yang dimutasi. Mutasi dilakukan cara merendam kalus pada konsentrasi EMS 0.0 ; 0.2 ; 0.4 ; 0.6 dan 0.8 selama 3 jam. Peubah yang diamati adalah persentase kalus hidup, bobot kalus, jumlah embrio somatik, dan jumlah kecambah yang dihasilkan, dan analisis molekuler menggunakan SSR. Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa terjadi penurunan jumlah persentase kalus yang hidup, bobot kalus, jumlah torpedo dan jumlah kecambah yang dihasilkan, seiring dengan meningkatnya konsentrasi EMS yang dberikan. Penurunan secara nyata terlihat ketika konsentrasi EMS 0.4. Lethal concentration 20 kalus kopi Arabika yang mampu bergenerasi berada pada konsentrasi 0.38, dan LC 50 pada konsentrasi 0.65. Hasil molekuler dari marka SSR menunjukkan bahwa terjadi perubahan pola pita dari planlet yang diberi perlakuan EMS 0.2 dan 0.8, pada ssr CMA 198, ssr M312 dan satu primer EST CS. Kata kunci : Coffea arabica L., kalus, induksi mutasi, lethal concentration, SSR 100

7. THE USE OF ETHYL METHANE SULPHONATE TO ENHANCE GENETIC DIVERSITY IN ARABICA COFFEE

Abstract Arabica coffee is self-pollinated annual plant, hence without breeding intervention will generate uniform population. To increase genetic diversity of Arabica coffee can be done using mutation induction. This study aimed to assess the possibility of EMS usage in in vitro culture to enhance genetic diversity of Arabica coffee. Callus of AS2K genotype was used as a mutated material. Mutation was performed by submersing callus in some EMS concentration 0.0, 0.2, 0.4, 0.6 and 0.8 for 3 hours. Parameters measured were percentage of living callus, callus weight, number of somatic embryos, number of germinated embryos and molecular analysis using SSR. The result revealed there was decrease in percentage of living callus, callus weight, number of torpedo embryos and the number of germinate embryos with the increase of EMS concentration. Significant decrease of all parameters was shown at 0.4 EMS concentration. The Lethal Concentration 20 LC 20 of Arabica coffee callus capable to regenerate was on EMS 0.38, while LC 50 was 0.65 EMS, soaking for 3 hours. The result of SSR analysis indicated changes in band pattern of plantlets treated with EMS at 0.2 dan 0.8 concentration at primary ssr CMA 198, ssr M312 and one of EST CS primary. Keywords : Coffea arabica L. Calli, Mutation induction, lethal concentration, SSR 101 Pendahuluan Perakitan varietas unggul baru untuk mendapatkan sifat tertentu seringkali memerlukan adanya populasi tanaman dengan keragaman genetik yang tinggi. Kopi Arabika merupakan tanaman tahunan yang menyerbuk sendiri, sehingga tampa adanya proses pemuliaan, populasi tanaman umumnya relatif seragam, sehingga terkadang sulit untuk mendapatkan tetua untuk bahan persilangan. Keragaman genetik secara konvensional dapat terjadi karena segregasi, rekombinasi atau mutasi alami. Mutasi alami terjadi secara spontan, sering sekali dikaitkan dengan faktor lingkungan. Mutasi ini terjadi secara lambat dan terus- menerus, sehingga memerlukan waktu yang lama untuk mengakumulasi mutan dalam populasi alami Damayanti 2002. Secara non konvensional, keragaman genetik juga dapat diinduksi melalui variasi somaklonal, perlakuan mutasi fisik dan kimia, fusi protoplas dan rekayasa genetika. Induksi mutasi adalah salah satu cara untuk meningkatkan keragaman genetik untuk melengkapi pemuliaan tanaman Odeigah et al. 1998. Mutasi buatan telah memberikan kontribusi nyata terhadap perbaikan tanaman di dunia Maluszynski et al. 1995. Mutagen yang berasal dari bahan kimia telah lama dicobakan untuk meningkatkan keragaman genetik tanaman, salah satunya adalah Ethyl Methane Sulfonate EMS. Penggunaan EMS telah berhasil menginduksi pembentukan mutan pada tanaman tembakau Gichner 2003, kubis-kubisan Sakamoto et al. 2002; Spasibionek 2006, pisang Roux 2004, kenaf Arumingtyas Indriyani 2005, apokat Yenisbar 2005 dan abaka Purwati 2007. Ethyl Methane Sulfonate merupakan mutagen kimia yang paling banyak digunakan karena toksitasnya tidak terlalu tinggi moderat toxic, memiliki efektifitas yang tinggi untuk menginduksi banyak mutasi multiple mutation per genom, biasanya mutasinya berupa subsitusi satu basa, harganya relatif lebih murah dibandingkan mutagen kimia lainnya, tersedia dipasaran, dan tidak meninggalkan racun setelah dihidrolisat. Ethyl Methane Sulfonate juga dilaporkan dapat mengubah lokus tertentu tanpa menginduksi sejumlah besar mutasi yang terpaut dekat dengan lokus tersebut sehingga sangat berguna bagi proses pemuliaan tanaman van Harten 1998; von Arnim 2005. Bila dibandingkan dengan metode pemuliaan mutasi secara in vivo, penggunaan metode in vitro memerlukan waktu yang lebih singkat untuk menghasilkan suatu varietas baru. Pada tahun pertama setelah perlakuan mutagen akan diperoleh keragaman genetik di antara tanaman mutan di laboratorium, sedangkan tahun kedua sampai ketujuh uji kestabilan genetik tanaman termutasi di rumah kaca dan lapangan, dan tahun kedelapan dapat melepas klon mutan. Keuntungan metode in vitro, isolasi jaringan termutasi akan lebih mudah dilakukan dengan cara multiplikasi tunas Donini et al. 1991. Program mutagenesis menurut Jain 2010 tergantung pada pemantapan prosedur regenerasi tanaman, optimasi perlakuan mutagen, dan evisiensi skrining populasi tanaman varian untuk mendapatkan mutan yang diinginkan. Mendapatkan prosedur regenerasi dari kalus yang telah diberi perlakuan mutasi, hanya dapat dilakukan apabila sistem regenerasi embriogenesis somatik telah dikuasai dengan baik, demikian juga apabila ingin mengoptimasi perlakuan mutagen yang akan digunakan. 102 Faktor kunci dalam melakukan induksi mutasi adalah penentuan dosis iradiasi atau konsentrasi bahan mutagen yang akan digunakan yang merupakan jumlah energi iradiasi atau banyaknya mutagen yang diabsorbsi oleh jaringan tanaman Gaul 1977; Ahloowalia Maluszynski, 2001. Sensitifitas terhadap mutagen dapat di ukur berdasarkan nilai LC lethal concentration yaitu konsentrasi yang menyebabkan kematian dari populasi tanaman yang di mutasi. Beberapa penelitian memperlihatkan bahwa variabilitas mutan tertinggi dalam menginduksi mutasi menggunakan mutagen kimia disekitar LC 20 - LC 50. Nilai LC 20 dan LC 50 akan berbeda-beda pada setiap genotipe tanaman. Selain menentukan kadar sensitifitas nilai LC 50 dapat digunakan untuk menghitung perkiraan konsentrasi dan waktu optimal yang diperlukan dalam menginduksi mutan Abdullah et al. 2009. Marka DNA memberikan alternatif terbaik dalam menganalisis keragaman genetik tanaman karena mampu memberikan polimorfik pita DNA dalam jumlah banyak, konsisten, tidak dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan tidak ada efek pleiotropi Brar 2002. Marka molekuler dapat diturunkan dan berasosiasi dengan genotip tertentu Asiedu et al. 1989, keterpautan dengan karakter yang diinginkan McCaskill Giovannoni 2002, dan pewarisannya mengikuti hukum mendel dan pewarisannya stabil Brar 2002. Penggunaan marka molekuler SSR dalam mengetahui keragaman genetik tanaman telah dilaporkan pada beberapa tanaman penting seperti pada padi Chakravarthi Naravaneni 2006, barley Becker Heun 1995, gandum Prasad et al. 2000, dan vanili Bory et al. 2008. Pada tanaman kopi selain telah digunakan untuk mengetahui keragaman genetik hasil persilangan Bhat et al. 2005 juga dipakai untuk membedakan antara tanaman diploid dan tetrapoid Moncada McCouch 2004. Pembentukan mutan melalui proses induksi mutasi menggunakan EMS pada pemuliaan kopi Arabika belum pernah dilaporkan. Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini bertujuan untuk melihat seberapa besar peluang untuk mendapatkan mutan putatif kopi Arabika dengan menggunakan EMS, dan mengevaluasi keragaman morfologi dan genetik yang dihasilkan dengan menggunakan marka molekular SSR. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi awal tentang keberadaan mutan baru yang dapat digunakan dalam perbaikan sifat tanaman kopi Arabika. Bahan dan metoda Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, Unit Pengembangan Benih Unggul Pertanian, Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian Indonesia, Laboratorium Morfologi Anatomi dan Sitologi Tumbuhan, Pusat Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia. Laboratorium Biologi Melekular, Balai Besar Sumber Daya Genetik Tanaman dan laboratorium Biologi Molekuler Tanaman Departemen Agronomi dan Hortikultura, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung dari Juni 2012 sampai April 2015. Penelitian ini terdiri dari 2 kegiatan yaitu : Induksi Mutasi Menggunakan EMS Pada Embrio Somatik Kopi Arabika,dan Evalusasi Keragaman Genetik putatif Mutan Planlet Kopi Asal Embrio Somatik. 103

1. Induksi Mutasi Menggunakan EMS pada Embrio Somatik Kopi Arabika

- Bahan tanaman Daun muda yang sudah membuka sempuna dari tanaman Kopi Arabika Coffea arabica varietas AS2K digunakan sebagi eksplan. Dipilihnya varietas ini karena mempunyai respon terbaik dalam menghasilkan jumlah embrio somatik pada penelitian sebelumnya, dan merupakan varietas yang lebih tahan terhadap penyakit karat. - Pelaksanaan Percobaan Kalus embriogenik yang terbentuk dari perlakuan induksi kalus diisolasi dan dikumpulkan di petridist. Kalus seberat dengan 2000 mg direndam dalam EMS 0.0 ; 0.2 ; 0.4; 0.6 dan 0.8 vv. Sebagai kontrol kalus embriogenik yang tidak direndam dalam EMS EMS 0.0 . Untuk melarutkan EMS digunakan larutkan dimetil sulfonat DMSO 4 vv. Sebelum digunakan larutan EMS disterillisasi menggunakan filter millipore ukuran 0.2 µM. Kalus yang direndam EMS selama 3 jam, kemudian dibilas 3 kali dengan aquades steril. Kalus yang telah direndam mutagen EMS dan kontrol dikulturkan dalam media induksi embrio. Kultur diinkubasikan dalam ruang gelap bersuhu ± 25 o C. Embrio somatik yang terbentuk kemudian dipindahkan ke media perkecambahan. Media diinkubasi dalam ruang kultur bersuhu ± 25 o C dengan penyinaran 1000 lux menggunakan lampu TL selama 16 jam. LD 20 dan LD50 ditentukan menggunakan curve fit analysis dengan menghitung jumlah kalus yang mampu beregenerasi. Parameter yang diamati adalah bobot basah kalus, jumlah torpedo, jumah kecambah dan jumlah planlet yang dihasilkan. 5. Evaluasi Keragaman Genetik Putatif Mutan Planlet Kopi Arabika - Bahan tanaman Daun kopi Arabika varietas AS2K dari planlet hasil mutasi dari beberapa konsentrasi EMS diambil untuk diuji dan akan dilihat seberapa besar variasi yang dihasilkan. Daun dari planlet yang tidak diberi EMS dijadikan sebagai tanaman kontrol. - Pelaksanaan percobaan Daun ditimbang ± 2 g, lalu diekstraksi menggunakan CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide metode Orozco-Castillo et al. 1994 yang telah dimodifikasi. Sebanyak 700 µl larutan bufer ekstraksi, mercapto ethanol 0.1 dan PVPP 1 ditambahkan ke dalam hasil gerusan, dan diingkubasi selama 1 jam pada suhu 65 C. Selanjutnya ditambahkan 500 µl kloroform dan isoamil alkohol 24:1, dicampur secara homogen dan disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit. Setelah disentrifugasi, supernatan larutan sebelah atas dipindahkan ke tabung mikro baru dan ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 500 µl, diikuti dengan penambahan sodium asetat 3M pH 5.2 sebanyak 50 µl. Larutan supernatan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit. 104 Tabel 20. Primer SSR yang digunakan dalam mendeteksi mutan putatif kopi Arabika hasil mutasi menggunakan EMS. No Primer Sekuen Motif Produk bp 1 ssrR105 a F-CACCAATTCCACTGACAATG R-TCCCTGCCAACACACTTC GA18 187-222 2 ssrR209 a F-CGGGGGTAAAAAGATTGTAA R-TTGGTGGGAGGGGAGTA GA16 161-173 3 ssrR268 a F-GTATCCCACAATGAAATCAC R-AGTAGAATTTTCAACATATAAG GA19 131-147 4 ssrA8847 a F-GCACACATGAAAAAGATGCT R-GATGGACAGGAGTTGATGG GT18GA18 159-192 5 ssrCMA008 a F-CATTCTGGTCCTGATGCTCT R-TCATTCACTTATTAACGTCCATC CT14TG10 106-128 6 ssrCMA059 a F-GATGGACAGGAGTTGATGGT R-TTTTAACACTCATTTTGCCAAT CT9CA8 129-165 7 ssrCMA198 a F-AGCAACTCCAGTCCTCAGGT R-TGGAAGCCCGCATATAGTTT TG9AG18 195-236 8 SSR119699 a F-GCCGTGGTGGAAGATGTACT R-CGAGTTCACCAAGAACGTCA AT5 89-110 9 SSR123557 a F-ATCTCCTCGTTCTTCCCCAT R-GCTTGTAGCAGGCAGGAAAC CT4 206-270 10 ssrR175 a F-GCAGTGACGCAGCAATG R-AAAAGGAGAGCCAAAGCAGT GA20 214-217 11 M428 b F-GGGCACCAAAGAAAGTGG R-GATGTGAAATGCAAGCAGGA AC9 231 12 M329 b F-ACTCAGACAAACCCTTCAAC R-GATGTTTTGCATCTATTTGG GT10 235 13 M363 b F-GCATCTTCGTCTTCTTTGG R-GAAACGGGCCACTTGA AT6AC7 131 14 M358 b F-CATGCACTATTATGTTTGTGTTTT R-TCTCGTCATATTTACAGGTAGGTT CA11 248 15 M312 b F-TTGCGTAAAGAGAACGAGCA R-GTGTGGAAAATTCACCTGAGC TG9 106-150 16 M840 b F-GTCAGAGGCAACTGTAGGTTAATG R-CCAAATCCACTATTTCTTGGTTG AC19 196 17 CS c F-GCCGAATGCTCCTTACTTTC R-CAGGATACAGGGGAATGGGATC EST 110-170 18 ICL c F-GGCACAGCATCAAGAACCT R-ATCCAGTATCGCCATCAGC EST 300 19 ETR c F-GAGATGGTCCCTGCATGTTA R-TTGCTCGTCTTGAACCATAGC EST 370 20 GAL c F-CAGGAACCCAGGATTACA R-AGTTCTGCCCAACAGTCA EST 200 Sumber : a Teressa et al. 2010 b Priyono dan Samirat 2012 c Pazzopane et al.2012 Pelet DNA diberi etanol 70 sebanyak γ00 μL, disentrifugasi 1γ.000 rpm selama 5 menit, kemudian cairan dalam tabung dibuang. Pelet DNA dikeringkan menggunakan oven 50 o C selama 10-15 menit atau dibiarkan selama 12 jam, kemudian ditambahkan larutan buffer TE 50 μL. Setelah kualitas dan kuantitas ditentukan, DNA dianalisis dengan tehnik Polymerase Chain Reaction PCR. Komposisi bahan untuk reaksi PCR terdiri atas H 2 O, enzim taq polimerisasi, primer forward dan reverse, dan DNA.