44
Daun yang telah steril dibilas sampai bersih menggunakan air steril sebanyak 3 kali. Daun dipotong dengan ukuran ± 1 cm x 1 cm, dan ditanam dalam
media induksi kalus. Kultur diinkubasi dalam ruang gelap pada temperatur ± 25
o
C dan kelembaban relatif ± 60.
Medium dasar yang digunakan untuk induksi kalus adalah 12 konsentrasi garam makro dan mikro MS Murashige and Skoog yang dilengkapi dengan
vitamin B5, sukrosa 30 g L
-1
, dan 250 mg L
-1
, Poliviynil polipyrolidon PVPP, dan kemudian ditambahkan phytagel 2.5 g L
-1
. Kombinasi zat pengatur tumbuh 2,4-D dan Thidiazuron yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Kombinasi zat pengatur tumbuh 2,4-D danThidiazuron
Perlakuan 2,4-D
Thidiazuron
1 4.5β μM
4.54 μM
2 4.5β μM
9.08 μM
3 4.5β μM
13.62 μM
4 4.5β μM
18.16 μM
5 4.5β μM
22.70 μM
6 9.04 μM
4.54 μM
7 9.04 μM
9.08 μM
8 9.04 μM
13.62 μM
9 9.04 μM
18.16 μM
10 9.04
μM 22.70
μM Percobaan dilakukan dengan sepuluh ulangan. Satu ulangan terdiri dari 5
potongan daun. Peubah yang diamati meliputi persentase pembentukan kalus dan bobot basah kalus yang terbentuk. Media induksi kalus lanjutan, induksi embrio
somatik, regenerasi dan perkecambahan yang digunakan sama dengan media yang digunakan pada tahap pertama. Pada induksi embrio somatik perlakuan diulang
sebanyak 10 kali, dimana setiap ulangan terdiri atas satu botol yang berisi klam kalus dengan berat masing-masing ± 200 mg kalus, sehingga untuk masing-
masing perlakuan dikulturkan sebanyak ± 5.000 mg kalus. Peubah yang diukur adalah persen kalus yang membentuk embrio somatik. Perkecambahan embrio
dilakukan dengan sepuluh ulangan. Peubah yang diamati jumlah kecambah yang terbentuk.
-
Analisis Data
Data yang diperoleh akan diuji secara statistik dengan metode 2 faktor untuk mencari nilai anova atau sidik ragamnya. Jika terdapat perbedaan yang nyata akan
dilakukan uji lanjut dengan Duncan Multiple Range Test DMRT pada taraf uji 5.
3. Morfologi Perkembangan Embrio Somatik Kopi Arabika
Perkembangan embrio somatik kopi Arabika dari mulai pembentukan kalus, embrio globular sampai planlet diamati dengan menggunakan mikroskop
AxioVision type Zeiss. Mikroskop dihubungkan dengan komputer dengan program AxioVision Release 4.82.
45
4. Induksi Embrio Somatik Sekunder Menggunakan Thidiazuron dan BAP
Eksplan yang digunakan untuk menginduksi embrio somatik sekunder adalah embrio somatik primer fase torpedo kopi Arabika dari varietas yang paling
respon dalam membentuk embrio somatik primer. Media MS padat dan semi padat yang dimodifikasi Etienne 2005 ditambahkan thidiazuron 4.54 µM dan 9.08
µM , dan sebagai kontrol digunakan media perkecambahan BAP 1.33 µM. Eksplan yang membentuk embrio somatik sekunder disub kultur ke media
pendewasaan. Kultur diinkubasi dalam ruang gelap dengan suhu ± 25
o
C sampai terbentuk embrio somatik sekunder.
Rancangan percobaan menggunakan acak lengkap faktorial, faktor pertama adalah ZPT dan yang kedua adalah kepadatan media. Percobaan dilakukan dengan
sepuluh ulangan. Satu ulangan terdiri dari 10 embrio fase kotiledonari. Peubah yang diamati meliputi: persentase pembentukan embrio somatik sekunder dan
jumlah embrio somatik sekunder yang dihasilkan.
Hasil dan Pembahasan 1.Embriogenesis somatik kopi Arabika menggunakan 2,4-D dan Thidiazuron
Daun kopi Arabika varietas Kartika mulai membentuk kalus setelah 3 minggu dalam media perlakuan. Kalus muncul dari luka bekas potongan Gambar
9. Hasil analisis statistik bobot basah eksplan satu bulan setelah tanam dapat dilihat pada Gambar 10. Peningkatan konsentrasi ZPT 2,4-D dan Thidiazuron
dapat menambah bobot basah eksplan, dengan bobot basah tertinggi pada perlakuan 2,4-D 9.04 µM + Thidiazuron 9.08 µM Gambar 10. Penggunaan
2,4-D yang dikombinasikan dengan Kinetin atau 2,4-D dengan BAP juga memperlihatkan pola yang sama, dimana penambahan 2,4-D sampai 0.94 µM
dapat meningkatkan bobot kalus Ibrahim et al. 2012; Ibrahim et al. 2013. Menurut Raghavan 1986 ini dikarenakan auksin dapat meningkatkan kuantitas
sel-sel embriogenik dengan cara memacu pembelahan sel untuk membentuk massa pro embriogenik, serta mencegah inisiasi pertumbuhan yang teratur pada
sel-sel tersebut.
Gambar 9. Keragaan kalus kopi Arabika varietas Kartika. A. Pada media induksi kalus 2,4-D 9.04 µM + Thidiazuron 9.08 µM 1 bulan
setelah tanam. B. Kalus embriogenik pada media induksi kalus lanjutan
A B
46
Gambar 10. Rataan pertambahan bobot basah eksplan kopi Arabika setelah dikulturkan selama 1 bulan di dalam media induksi kalus awal.
Huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05
Persentase pembentukan kalus 3 bulan dalam media induksi kalus lanjutan terlihat bervariasi. Berat terendah pada konsentrasi 2,4-D 2.26 µM yang
dikombinasikan dengan thidiazuron 4.54 atau 9.08 µM Gambar 11. Secara morfologi proses pengkalusan tidak terjadi dan jika ada terlihat tidak embriogenik.
Pada bekas potongan daun apabila diamati dibawah mikroskop justru terlihat adanya pro embrio dengan warna kekuningan. Hal ini berbeda dengan perlakuan
2,4-D 4.52 µM yang ditambahkan Thidiazuron 4.54 dan 9.08 µM, serta 2,4-D 9.04 µM + Thidiazuron 9.08 µM justru memperlihatkan proses pengkalusan yang
nyata. Kalus non embriogenik kopi Arabika juga dilaporkan oleh Gatica et al. 2008. Penelitian Gatica et al. 2008 mendapatkan frekwensi kalus yang rendah
dengan struktur kompak dalam menginduksi embriogenesis somatik kopi Arabica cv.Catura dan Catuai.
Hasil penelitian memperlihatkan bahwa morphogenesis pembentukan kalus kopi sangat tergantung pada rasio auksin dan sitokinin yang ditambahkan dalam
media induksi kalus. Umumnya pembentukan kalus ditemukan apabila konsentrasi auksin dan sitokinin diberikan dalam konsentrasi tinggi George
Sherrington 1984; Tores 1989. Pemberian Auksin sangat diperlukan dalam embriogenesis somatik karena berkaitan dengan proses asidifikasi sitoplasma dan
dinding sel tanaman Kutschera 1994.
Adanya perbedaan respon eksplan dalam menghasilkan kalus dan pro embrio menandakan bahwa pada perlakuan 2,4-D 2.26 µM yang dikombinasikan
dengan thidiazuron 4.54 atau 9.08 µM merupakan jalur embriogenesis somatik langsung sementara pada perlakuan lainnya melalui jalur embriogenesis tidak
langsung. Kalus embriogenik yang muncul dari embriogenesis somatik tidak langsung berwarna kekuningan. Kalus terlihat muncul dari luka bekas potongan
daun kopi Arabika dan bertambah banyak seiring dengan bertambahnya waktu Gambar 9B. Menurut Williams dan Maheswaran 1986 karekteristik kalus
embriogenik berwarna kekuningan, sitoplasma yang lebih padat, inti sel yang besar, dan vakuola yang banyak mengandung pati.
47
Gambar 11. Rataan persentase eksplan kopi Arabika membentuk kalus dalam media induksi kalus lanjutan 4 bulan setelah kultur. Huruf yang
sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan α = 0.05
Perbedaan respon perkembangan eksplan menjadikan metoda yang ditempuh agak berbeda. Pada eksplan yang membentuk kalus, kalus embriogenik
yang terbentuk ditimbang seberat 100 mg L
-1
, lalu di subkultur ke media induksi embrio somatik. Sementara eksplan tidak membentuk kalus tetapi langsung
menghasilkan pro embrio juga disubkultur ke media yang sama tanpa dilakukan penimbangan.
Pada proses embriogenesis tidak langsung, dua bulan dalam media pendewasaan, kalus berubah warna dari kuning menjadi kuning kecoklatan.
Pengamatan dibawah mikroskop di bulan ketiga, dari kalus yang berwarna kuning kecoklatan muncul pro embrio, yang dibulan keempat berkembang menjadi
embrio globular. Dibulan ke lima dan enam, globular mengalami pemanjangan dan pada bulan ke delapan torpedo sudah terbentuk sempurna dan akan memasuki
tahap kotiledonari. Perkembangan embriogenesis tidak langsung kopi Arabika varietas Kartika dari fase globular sampai kotiledonari dapat dilihat pada
Gambar 12.
Perkembangan pro embrio menjadi embrio globular pada embriogenesis somatik langsung terlihat setelah dua bulan dalam media regenerasi.
Perkembangan embriogenesis somatik langsung terlihat tidak serentak, dimana embrio globular, hati, pemanjangan embrio dan torpedo dapat dijumpai pada saat
yang besamaan dalam media yang sama Gambar 13. Fenomena ini juga dijumpai pada penelitian Gatica et al. 2008 dan Oktavia et al. 2003 ketika
menginduksi embriogenesis somatik langsung Coffea arabica dengan ZPT yang berbeda. Ketidak serentakan perkembangan embrio ini terkadang menyebabkan
embriogenesis langsung jarang digunakan dalam proses mutasi dan perbanyakan tanaman.
