Jenis Penelitian Penelitian ini adalah penelitian eksperimental true experimental designs Definisi Operasional Etika Penggunaan Hewan Analisis Data

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian Penelitian ini adalah penelitian eksperimental true experimental designs

dengan rancangan post test only control group design, menggunakan kelompok kontrol dan kelompok perlakuan, dengan randomisasi sederhana. Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus jantan Wistar yang dibagi secara acak menjadi 6 kelompok. 3.2 Lokasi dan Waktu 3.2.1 Lokasi Penelitian Pemeliharaan dan perlakuan pada hewan percobaan dilakukan di Laboratorium Farmasi Universitas Sumatera Utara USU, Medan. Pemeriksaan KGD dengan Spektrofotometer dilakukan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran USU. Sedangkan pembuatan sediaan HE dan imunohistokimia dengan antibodi anti- insulin pada jaringan pankreas dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor IPB.

3.2.2 Waktu Penelitian

Penelitian ini berlangsung selama 12 minggu, dari bulan November 2013 sampai dengan Januari 2014. 3.3 Populasi dan Sampel Penelitian 3.3.1 Populasi Populasi penelitian ini adalah tikus Wistar jantan Rattus novergicus dengan berat badan 150 – 250 g. Universitas Sumatera Utara

3.3.2 Sampel

Pengambilan sampel dilakukan secara purposive sampling. Penentuan besar sampel dilakukan dengan menggunakan rumus Federer 1963. Rumus Federer : n-1 x t-1 15 Keterangan: n = jumlah sampel tiap kelompok t = banyaknya kelompok = n – 1 x 6 – 1 15 = n – 1 x 5 15 = 5n – 5 15 = 5n 20 = n 4, dengan demikian, setiap kelompok terdapat minimal 4 ekor tikus Wistar jantan. Untuk mencegah kekurangan sampel akibat kematian, peneliti memilih menggunakan 6 ekor tikus Wistar jantan tiap kelompok dengan jumlah kelompok sebanyak 6 kelompok sehingga jumlah seluruh subjek penelitian sebanyak 36 ekor. Sampel jaringan untuk pengukuran morfologi sel pankreas akan diambil secara acak sebanyak 4 ekor setiap kelompoknya. Begitu juga dengan sampel darah untuk pemeriksaan KGD. 3.4 Variabel Penelitian 3.4.1 Variabel Bebas Variabel bebas pada penelitian ini adalah : a. Ekstrak etanol jamur tiram Putih Pleurotus ostreatus 200 mgkgBB dan 250 mgkgBB b. Streptozotocin 30 mgkgBB Universitas Sumatera Utara c. Pakan tinggi lemak high fat diet berupa kuning telur bebek 1 cctikushari

3.4.2 Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah kadar gula darah KGD dan gambaran sel pankreas secara imunohistokimia.

3.4.3 Variabel Kendali

Variable kendali adalah variabel luar yang dapat dikendalikan melalui homogenisasi, yaitu: a. Umur : Tikus berusia 2 - 3 bulan. b. Variasi genetik : Tikus Wistar Rattus novergicus c. Jenis kelamin : Semua tikus yang digunakan dalam penelitian ini berjenis kelamin jantan. d. Suhu lingkungan : Tikus ditempatkan dalam ruangan dengan suhu 28–30 °C. e. Jenis makanan : Tikus mendapatkan makanan berupa pakan standar, diberikan pada tikus dua kali sehari, setiap pagi dan sore hari berupa pellet dengan dosis 20 gekorhari. f. Kondisi psikologis : Pengaruh ini dapat dikurangi dengan adanya waktu adaptasi sebelum percobaan dan pemisahan subyek penelitian dalam kandang yang terpisah.

3.5 Definisi Operasional

Ada beberapa uraian yang dianggap penting dalam penelitian ini, yaitu : No Variabel Definisi Operasional Skala 1. Ekstrak etanol jamur tiram putih Pleurotus ostreatus Ekstrak yang didapat dengan menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol. Nominal 2. Pakan tinggi lemak high fat Pakan tinggi lemak HFD adalah kuning telur bebek sebanyak 1 Nominal Universitas Sumatera Utara diet cctikushari. 3. Streptozotocin dosis rendah STZ dosis rendah adalah STZ sebanyak 30 mgkgBB Bas et al., 2012; Parveen et al., 2011 yang diberikan kepada kelompok P 1 , P 2 dan P 3 dengan jalan injeksi intraperitoneal. Nominal 4. KGD Kadar Gula Darah KGD adalah kadar glukosa di dalam serum darah. Pengambilan darah dilakukan dengan memotong ujung ekor sebanyak ± 1 mm, lalu darah diambil dengan cara diteteskan pada stik pemeriksaan glukosa darah. Numerik 5. Sel pankreas Sel pankreas adalah sel yang memproduksi hormon insulin untuk mempertahankan KGD tetap dalam batas normal yang dihitung pada sediaan imunohistokimia dengan cara mengambil 5 pulau Langerhans, lalu dihitung jumlah total dari area sel , lalu dibagi 5. Numerik

3.6 Etika Penggunaan Hewan

Penggunaan dan penanganan hewan di laboratorium penelitian dilakukan sesuai dengan aturan etika penelitian hewan coba yang diatur dalam Deklarasi Helsinki untuk memperoleh Ethical clearance dari komite etik dan komite ilmiah penelitian FMIPA Biologi USU Medan. 3.7 Alat dan Bahan 3.7.1 Alat Alat- alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: a. Timbangan digital Kern dengan kapasitas 600 gram dengan skala terkecil 0,000 untuk menimbang berat badan tikus. b. Timbangan digital dengan kapasitas 10 gram dengan skala terkecil 0,0000 untuk menimbang Streptozotocin. Universitas Sumatera Utara c. Kandang tikus ukuran 50 x 30 x 20 cm 3 yang diberi kawat penutup, lengkap dengan tempat pakan dan minum sebanyak 8 buah sebagai tempat pemeliharaan tikus. d. Spuit 1 cc. e. Gelas ukur untuk mengukur jamur tiram putih. f. Seperangkat alat ekstraksi untuk mengekstrak jamur tiram putih, antara lain: oven, alat penggiling, toples maserasi, corong pisah, rotary evaporator, dan freeze dryer . g. Jarum sonde untuk memasukkan ekstrak jamur tiram putih melalui oral ke tikus percobaan. h. Cawan petri sebagai tempat pengeringan ekstrak. i. Alat-alat untuk bedah tikus terdiri atas papan wax, jarum, pinset anatomis, pinset chirurgis, gunting, scalpel, dan penyemprot alkohol.

3.7.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: a. Konsentrat pakan yang diperoleh dari PT. Charoen Pokphan, Tanjung Morawa, Medan, dengan komposisi hasil analisis yang terinci sebagai berikut: kadar air 14, protein kasar 18-20, lemak kasar 4-7, serat kasar 4-7, abu 5-7, kalsium 0,70-1, fosfor 0,6. b. Streptozotocin, produk Nacalai Tesque, Jepang. c. Buffer citrate dengan pH 4,5 sebagai pelarut Streptozotocin untuk injeksi intraperitoneal. d. Pakan tinggi lemak, berupa kuning telur bebek. Universitas Sumatera Utara e. Ekstrak etanol jamur tiram putih, diberikan sesuai dengan dosis yang telah ditentukan. Jamur tiram putih yang diperoleh dari pusat budidaya jamur tiram Khalisa Agro Mushroom, beralamat di Jl. Tampok Tanjung Selamat Gg. Seni no.2, Sunggal Sumatera Utara f. Etanol 96. g. Aquadest. 3.8 Prosedur Penelitian 3.8.1 Persiapan Hewan Percobaan Tikus diaklimatisasi selama satu minggu dan ditempatkan di dalam kandang yang terbuat dari bahan plastik ukuran 50 x 30 x 20 cm 3 yang ditutup dengan kawat kasa. Setiap kandang diisi paling banyak 5 ekor tikus. Tikus yang sakit saat aklimatisasi segera di ganti dengan tikus lain dengan kriteria yang sama yang diambil secara acak. Dasar kandang dilapisi dengan sekam padi setebal 0,5 – 1 cm dan diganti setiap tiga hari. Cahaya ruangan dikontrol persis 12 jam terang pukul 06.00 sampai dengan pukul 18.00 dan 12 jam gelap pukul 18.00 sampai dengan pukul 06.00, sedangkan suhu dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah. Diberikan makanan standard yang sama untuk tiap kelompok, sedangkan pemberian minuman diberikan secara ad libitum. Pemberian makanan dan minuman disuplai setiap hari. Penelitian diawali dengan mempersiapkan tikus Wistar jantan usia 2 – 3 bulan sejumlah 36 ekor yang diadaptasi selama 7 hari dengan pemberian pakan standar. Berat badan tikus ditimbang sebagai data dasar. Tikus kemudian dikelompokkan secara acak menjadi 6 kelompok, tiap kelompok terdiri dari 6 ekor. Universitas Sumatera Utara

3.8.2 Ransum Pakan Standar

Ransum pakan standar adalah makanan bagi semua tikus selama penelitian dengan dosis 20 gekorhari. Ransum pakan dibuat berdasarkan diet murni dari PT. Charoen Pokphan, Tanjung Morawa, Medan.

3.8.3 Pemberian Air Minum

Air minum untuk semua tikus adalah aquadest. Air minum diberikan ad libitum.

3.8.4 Pembagian Kelompok dan Pemberian Perlakuan

Pembagian kelompok dan pemberian perlakuan pada penelitian ini adalah: a. Tikus sebanyak 36 ekor dibagi dalam enam kelompok secara random sehingga dalam satu kelompok terdiri atas enam ekor tikus. Pembagian kelompoknya adalah : i. Kelompok P = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi minum aquadest, pakan biasa selama 56 hari, dan suntikan citrate buffer pada hari ke 15 dan 22. ii. Kelompok P 1 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi perlakuan diet tinggi lemak selama 14 hari, lalu diberikan suntikan STZ dosis rendah 30 mgkgBB pada hari ke 15 22. iii. Kelompok P 2 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi perlakuan diet tinggi lemak bersamaan dengan ekstrak etanol jamur tiram putih 200 mgkgBB selama 2 minggu, yang kemudian diberikan suntikan STZ dosis rendah 30 mgkgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu pemberian ekstrak etanol jamur tiram putih terus dilanjutkan sampai 1 minggu setelahnya. Universitas Sumatera Utara iv. Kelompok P 3 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi perlakuan diet tinggi lemak bersamaan dengan ekstrak etanol jamur tiram putih 250 mgkgBB selama 2 minggu, yang kemudian diberikan suntikan STZ dosis rendah 30 mgkgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu pemberian ekstrak etanol jamur tiram putih terus dilanjutkan sampai 1 minggu setelahnya. v. Kelompok P 4 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi perlakuan diet tinggi lemak selama 14 hari, lalu diberikan suntikan STZ dosis rendah 30 mgkgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu diberikan ekstrak etanol jamur tiram putih sebanyak 200 mgkgBB selama 28 hari. vi. Kelompok P 5 = terdiri dari 6 ekor tikus jantan dewasa yang diberi perlakuan diet tinggi lemak selama 14 hari, lalu diberikan suntikan STZ dosis rendah 30 mgkgBB pada hari ke 15 dan 22, lalu diberikan ekstrak etanol jamur tiram putih sebanyak 250 mgkgBB selama 28 hari. b. Pemberian pakan tinggi lemak kuning telur bebek dilakukan dengan cara pencekokan dan dilakukan setiap hari pada pukul 09.00 WIB. c. Pemberian ekstrak etanol jamur tiram putih dilakukan dengan cara pencekokan dan dilakukan setiap hari pada pukul 14.00 WIB. d. Penyuntikan STZ dosis rendah 30 mgkgBB dilakukan dengan sebelumnya tikus dipuasakan semalaman, lalu pagi pada pukul 09.00 WIB sebelum pemberian pakan tinggi lemak dilakukan penyuntikan STZ intraperitoneal. e. Selama 7 hari tikus diadaptasikan dengan lingkungan tempat penelitian dan diberi makanan standar untuk tikus. f. Berat badan awal tikus ditimbang. Universitas Sumatera Utara g. Setelah 58 hari perlakuan, dilakukan dislokasi leher tikus. Abdomen dibuka dengan insisi mid-line, dilakukan pemisahan pankreas, lalu pankreas direndam didalam formalin buffer untuk selanjutnya dilakukan pembuatan sediaan histologi. h. Dilakukan analisis dari data-data KGD dan gambaran imunohistokimia area sel beta pankreas. 3.8.5 Pembuatan Ekstrak Etanol Jamur Tiram Putih Pleurotus ostreatus 3.8.5.1.Proses pengambilan bahan Bahan yang digunakan adalah jamur Pleurotus ostreatus yang masih segar dan baru dipanen. Pengambilan bahan dilakukan dengan cara purposif tanpa membandingkan dengan tumbuhan yang sama dari daerah lain. Bahan diperoleh dari pusat budidaya jamur tiram Khalisa Agro Mushroom, beralamat di Jl. Tampok Tanjung Selamat Gg. Seni no.2, Sunggal Sumatera Utara. 3.8.5.2.Proses pembuatan ekstrak Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai. Kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan. Ekstrak cair adalah sediaan cair simplisia nabati, yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet atau sebagai pelarut dan pengawet. Ekstrak cair yang cenderung membentuk endapan dapat didiamkan dan disaring atau bagian yang bening dienaptuangkan. Beningan yang diperoleh memenuhi persyaratan farmakope. Ekstrak cair dapat dibuat dari ekstrak yang sesuai. Depkes, 1995 Universitas Sumatera Utara Berikut prosedur pembuatan ekstrak etanol jamur tiram putih hingga dalam bentuk suspensi yang siap diberikan kepada tikus : 1. Sebanyak 25 kg jamur tiram putih pasca panen, keseluruhan bagian jamur dipotong-potong tipis lalu dikeringkan. Pengeringan menggunakan oven pada suhu 38 – 40 C sampai potongan buah benar-benar kering rapuh. Lamanya waktu yang dibutuhkan untuk pengeringan sekitar 4-5 hari. Berat jamur setelah dikeringkan sekitar 2874 g. 2. Jamur yang telah benar-benar kering ini dihaluskan dengan menggunakan alat penggiling. Hasil penggilingan diperoleh serbuk simplisia sekitar 1421,5 g. Simplisia ini kemudian diekstrak dengan menggunakan metode maserasi. 3. Maserasi dilakukan dengan cara sebagai berikut: sebanyak 1000 g simplisia direndam di dalam 4 liter larutan etanol 96 yang sebelumnya telah didestilasi. Perendaman dilakukan selama 3 hari 3 malam sambil sesekali diaduk. Setelah 3 hari, campuran simplisia dan pelarut kemudian disaring kedalam penyaring. Residu yang dihasilkan dari penyaringan tersebut direndam kembali dengan pelarut yang sama sebanyak 4 liter selama 3 hari 3 malam, kemudian disaring kembali. Siklus ini diulang sekali lagi dengan cara yang sama. Filtrat yang diperoleh dari hasil penyaringan, diuapkan menggunakan rotary evaporator pada kisaran temperatur 40 – 60 C, dan diperolehlah ekstrak kental jamur PO sebanyak 540,2 g. 4. Selanjutnya ekstrak kental ini dikeringkan dengan menggunakan freeze dryer untuk menguapkan pelarut yang masih tersisa, hingga diperoleh ekstrak kering jamur PO sebanyak 254,3 g. Selanjutnya ekstrak kering akan dijadikan suspensi dengan pelarut Na-CMC 1. Universitas Sumatera Utara 5. Pembuatan larutan Na-CMC 1. Na-CMC ditimbang seberat 20 g dan dilarutkan dalam 400 mL aquadest. Na-CMC dibiarkan mengambang diatas aquadest selama kurang lebih 15 menit sambil diaduk. Setelah terbentuk massa yang homogen merata ditambahkan air ke dalam massa tersebut hingga diperoleh volume 2000 mL sambil terus diaduk. 6. Pembuatan suspensi ekstrak etanol jamur PO Suspensi 4 . Pembuatan suspensi ekstrak etanol jamur dilakukan setiap hari. Ekstrak kering jamur PO ditimbang sebanyak 0,6 g dan dimasukkan ke dalam lumpang. Kemudian ditambahkan 10 mL larutan Na-CMC 1 sedikit demi sedikit sambil dilakukan penggerusan supaya didapatkan larutan yang homogen. Larutan yang sudah homogen selanjutnya dipindahkan ke dalam gelas ukur dan ditambahkan lagi Na- CMC hingga volume akhir 15 ml. Suspensi ini kemudian diberikan secara oral ke tikus dengan dosis 200 mgkgBB dan 250 mgkgBB tikus.

3.8.6 Penentuan Dosis

1. Perhitungan dosis ekstrak etanol jamur tiram puti Dosis ektrak jamur tiram putih yang digunakan untuk berbagai kondisi patologis adalah antara 200-250 mgkg BB tikus Isai et al. 2009. Dosis ekstrak jamur tiram putih yang digunakan pada penelitian ini adalah sebesar 200 mgkg BB dan 250 mgkgBB. Tikus ditimbang berat badannya setiap minggu, dan larutan ekstrak etanol jamur tiram putih akan diberikan sesuai dengan berat badan masing-masing tikus. Perhitungan dosis mingguan dilakukan dengan mempertimbangkan besar kadar air pada ekstrak jamur PO yang digunakan pada penelitian ini yaitu sekitar 8. 2. Perhitungan dosis kuning telur bebek Universitas Sumatera Utara Kuning telur bebek diberikan sebanyak 1 cctikushari dengan melihat kapasitas lambung tikus yang bisa menampung 3-5 cc. Pada penelitian sebelumnya dengan dosis 1 cc bisa meningkatkan kadar kolesterol dan berat badan tikus dalam waktu 2 minggu. 3. Perhitungan dosis STZ Dosis STZ yang diberikan adalah dosis rendah multipel sebanyak 30 mgkgBB yang dilarutkan dalam citrate buffer pH 4,5. Jika seminggu setelah penyuntikan pertama tidak terjadi kenaikan KGD diatas 140 mgdL maka dilakukan penyuntikan ke-2 Srinivasan et al., 2005. Universitas Sumatera Utara

3.8.7 Alur Penelitian Secara skematis, alur alur penelitian ini ditunjukkan pada Gambar 3.1.

Tikus jantan galur wistar, 36 ekor, 2-3 bulan, BB 150-250 gram Adaptasi selama 7 hari Tikus dibagi menjadi 6 kelompok Kelompok kontrol P Kelompok P 1 Kelompok P 2 Kelompok P 3 Akuades 0,5ml selama 56 hari + Pakan biasa selama 56 hari + Suntikan citrate buffer IP hari ke 15 22 Akuades 0,5ml selama 56 hari + HFD 1 cchari selama 14 hari dilanjut dengan pakan biasa hingga hari ke 56 + STZ 30 mgkgBB IP hari ke 15 22 Akuades 0,5ml + HFD 1 cchari selama 14 hari dilanjut dengan pakan biasa hingga hari ke 56 + STZ 30 mgkgBB IP hari ke 15 22 + Ekstrak PO 200 mgkg BB Sampai hari ke 28 Akuades 0,5ml + HFD 1 cchari selama 14 hari dilanjut dengan pakan biasa hingga hari ke 56 + STZ 30 mgkgBB IP hari ke 15 22 + Ekstrak PO 250 mgkgBB Sampai hari ke 28 Pengukuran KGD + pemeriksaan histologi pankreas data post test Analisis data Kelompok P 4 Akuades 0,5ml + HFD 1 cchari selama 14 hari dilanjut dengan pakan biasa hingga hari ke 56 + STZ 30 mgkgBB IP hari ke 15 22 + Ekstrak PO 200 mgkgBB Hari ke 29 - hari ke 56 Kelompok P 5 Akuades 0,5ml + HFD 1 cchari selama 14 hari dilanjut dengan pakan biasa hingga hari ke 56 + STZ 30 mgkgBB IP hari ke 15 22 + Ekstrak PO 250 mgkgBB Hari ke 29 - hari ke 56 Gambar 3.1 Alur Penelitian Universitas Sumatera Utara 3.9. Prosedur Pemeriksaan 3.9.1. Prosedur pembuatan preparat imunohistokimia Pemeriksaan sel pankreas dengan membuat preparat imunohistokimia dengan menggunakan metode paraffin. Tahap-tahap pembuatan preparat adalah sebagai berikut: 1 Fiksasi Pankreas yang sudah diambil melalui pembedahan difiksasi dalam larutan buffer formalin 10 2 Dehidrasi Proses dehidrasi dilakukan secara bertahap. Pertama dilakukan dehidrasi dalam larutan alkohol 50, 70, 80, 95, 100 dengan lama waktu yang sama untuk setiap kadar alkohol yaitu 90 menit sebanyak 2 kali 3 Clearing Pankreas dimasukkan kedalam larutan yang berisi xylol selama 90 menit 4 Infiltrasi Proses infiltrasi dilakukan dengan memasukkan pankreas kedalam larutan parafin 90 menit dan dilakukan sebanyak 2 kali. Infiltrasi dilakukan di dalam oven dengan suhu 60 °C 5 Embedding Pankreas dan larutan paraffin dimasukkan kedalam cetakan blok paraffin dan dibiarkan selama ± 3 jam atau sampai paraffin membeku 6 Sectioning Blok paraffin yang sudah terbentuk dilakukan pemotongan dengan rotary microtom . Jaringan dipotong dengan ketebalan 3 – 4 µm dan diletakkan diatas Universitas Sumatera Utara object glass poly-L-lysine, kemudian dibiarkan di inkubator selama semalam pada suhu 40 °C 7 Deparafinisasi Preparat secara berurutan dimasukkan kedalam larutan xylol, alkohol 100, alkohol 95, alkohol 80, alkohol 70, alkohol 50, selama masing- masing 90 menit sebanyak 2 kali 8 Peroxidase blocking dengan 0.3 H 2 O 2 dalam methanol selama 20 menit 9 Preparat dicuci dengan Phosphat Buffer Saline PBS 10 sebanyak 3 x 5 menit. 10 Kemudian dilakukan non-specific blocking dengan 10 serum normal selama 30 menit. 11 Kemudian diinkubasi dengan antibody primer anti insulin di suhu 4°C selama 18 – 22 jam 12 Kemudian preparat dicuci dengan Phosphat Buffer Saline PBS 10 sebanyak 3 x 5 menit. 13 Kemudian ditetesi dengan antibodi sekunder universal antibody selama 30 menit 14 Kemudian preparat dicuci dengan Phosphat Buffer Saline PBS 10 sebanyak 3 x 5 menit. 15 Kemudian ditetesi dengan Chromogen 3,3 diaminobenzedine selama 5 – 10 detik. 16 Kemudian dicuci dengan aquadest 17 Diberi counterstain dengan Hematoxylin Mayer 5 – 10 detik dilanjutkan cuci dengan air kran mengalir 10 – 15 menit Universitas Sumatera Utara 18 Dehidrasi dengan dimasukkan ke dalam alkohol 80, alkohol 95, alkohol absolut xylol 2 kali 19 Mounting dengan menggunakan E. Z mount.

3.9.2. Prosedur Analisa Preparat Imunohistokimia

Pembacaan preparat imunohistokimia dilakukan dengan modifikasi metode Rato dkk, menggunakan mikroskop cahaya dengan kamera otomatis Matsuoka Nissei, Japan pada pembesaran 400x. Area yang terwarnai antibodi anti-insulin area sel beta berwarna cokelat. Analisa data menggunakan software imageJ yang dikembangkan oleh National Institutes of Health NIH Amerika Serikat. Analisa menggunakan perbandingan antara regions of interest ROI pada masing-masing gambar. Caranya adalah sebagai berikut: - definisi manual dari ROI-1 – yaitu pulau Langerhans. - pengukuran area ROI-1 - definisi area sel beta pankreas – ROI-2 - pengukuran ROI-2 Dari hasil tersebut didapatlah persentase sel beta pankreas yang ada dalam sebuah pulau Langerhans Rato et. al., 2013. Hasilnya didapatkan dengan membandingkan antara satu area sel beta pankreas dengan rata-rata keseluruhan area pulau Langerhans. Persentase pada satu sampel didapatkan dari hasil rata-rata 5 pulau Langerhans pada setiap sampelnya.

3.9.3 Prosedur Pemeriksaan KGD

Pemeriksaan KGD dilakukan dengan menggunakan kit Diasys dan spektrofotometer. Sebanyak 10 µl serum direaksikan dengan 1000 µl reagen, dicampur dengan bantuan vortex selama 1 menit. Pembacaan aktivitas KGD Universitas Sumatera Utara dilakukan pada panjang gelombang 500 nm, pada suhu 20 – 25 °C. Kadar Gula Darah dalam satuan mgdL dapat diukur dengan alat spektrofotometer dengan menggunakan metode GOD-PAP. Glukosa ditentukan setelah oksidasi enzimatis dengan adanya glukosa oksidase, hidrogen peroksida yang terbentuk akan bereaksi dengan adanya peroksidase dengan phenol serta 4-aminophenazone menjadi warna quinoneimine yang berwarna merah violet Kurniasari, 2004. Hasil pembacaan dari alat spektrofotometer dicatat, kemudian KGD dihitung dengan menggunakan rumus di bawah ini : Perhitungan: Glucose mgdL = [A sampleA StdCal] x Conc.StdCal [mgdl]

3.10 Analisis Data

Analisis data pada penelitian ini berdasarkan data KGD dan jumlah sel pankreas yang mengalami degenerasi pada seluruh kelompok percobaan. Data dipresentasikan dalam bentuk rata-rata ± simpangan baku rata-rata ± SD. Terlebih dahulu dilakukan analisis normalitas data dengan uji normalitas Shapiro- Wilk karena jumlah sampel 50 dan uji varians dengan uji Levene. Jika data berdistribusi normal dan homogen maka dilakukan uji One Way Anova. Bila pada uji ANOVA diperoleh hasil p 0,05, maka dilanjutkan dengan melakukan analisis uji Post Hoc Bonferroni untuk melihat perbedaan antara kelompok perlakuan. Jika distribusi data tidak normal dan atau tidak homogen, barulah dilakukan uji Kruskal Wallis. Untuk melihat perbedaan antara kelompok perlakuan mengunakan uji Mann Whitney. Semua analisis data dilakukan dengan Universitas Sumatera Utara menggunakan SPSS. Dalam penelitian ini, hanya perbedaan rata-rata pada 0,05 yang dianggap nyata bermaknasignifikan Dahlan, 2009 Universitas Sumatera Utara

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Identifikasi dan Skrining Jamur Tiram Putih

Hasil pemeriksaan dan identifikasi jamur tiram putih Pleurotus ostreatus adalah sebagai barikut lampiran 1: Tabel 4.1 Hasil Identifikasi dan Klasifikasi Jamur Tiram Identifikasi: • Tubuh buah putih-krem • Pilleus berbentuk setengah lingkaran seperti cakram • Tangkai buah tumbuh menyamping • Diameter pilleus 5 – 20 cm • Miselia berwarna putih Klasifikasi: • Kingdom : Fungi • Phylum : Basidiomycota • Class : Agaricomycetes • Order : Agaricales • Family : Pleurotaceae • Genus : Pleurotus • Spesies : Pleurotus ostreatus Hasil skrining fitokimia adalah sebagai berikut lampiran 2 dan 3: Tabel 4.2 Hasil Skrining Fitokimia untuk Simplisia dan Ekstrak Simplisia Ekstrak • Alkaloida : + • Saponin : + • Flavonoida : + • Triterpen : + • Glikosida : + • Kadar air : 9,96 • Alkaloida : - • Saponin : + • Flavonoida : + • Triterpen : + • Glikosida : + • Kadar air : 8 Universitas Sumatera Utara