31
mikroskopis dengan metode paraffin. Pembuatan sediaan mikroskopis ini dilakukan di Departemen Histologi Universitas Indonesia, Salemba.
3.4.7 Tahap pewarnaan Tunel
Pada penelitian ini dilakukan pewarnaan TdT-mediated dUTP nick end- labeling TUNEL untuk dapat mengidentifikasi apoptosis sel pada masing-
masing kelompok. Kit pewarnaan TUNEL yang digunakan adalah Takara bio. pada setiap kelompok diambil 2 sampel pada kelompok normal dan 3 sampel
pada kelompok D dan D+Cc untuk dijadikan dilakukan pewarnaan. Tahap pewarnaan Tunel Takara bio sebagai berikut:
3.4.7.1 Deparafinisasi
Preparat mikroskopis yang telah siap, diletakan pada rak preparat, dan kemudian dicelupkan secara berurutan kedalam 3 toples yang berisi
cairan xylene I, xylene II, dan xylene III dengan cara bergantian masing- masing selama 5 menit. Pada saat pencelupan, toples diletakkan diatas
Rotamax dengan pengaturan kecepatan ±125 rpm. Setiap sebelum diputar dengan Rotamax preparat diangkat celup sebanyak 3 kali terlebih
dahulu. Selanjunya preparat dicelupkan secara berurutan kedalam toples
yang berisi cairan ethanol 100, ethanol 100, ethanol 90, dan ethanol 70 masing-masing selama 5 menit. Setiap pencelupan, toples
diletakkan juga diatas Rotamax dengan pengaturan kecepatan ±125 rpm. Preparat kemudian dicelupkan ke dalam toples berisi DW dan diletakkan
diatas Rotamax selama 2 menit.
3.4.7.2 Proses Enzimatik
Mengeringkan dan meletakkan preparat secara berjajar diatas alas. Kemudian meneteskan Proteinase K sebanyak 10-20 µgml dan
didiamkan pada suhu ruangan selama 15 menit. Preparat diletakkan kembali pada rak preparat dan dicelupkan kedalam toples berisi cairan
PBS yang selanjutnya diputar diatas Rotamax sebanyak 2 kali dengan PBS yang berbeda masing-masing selama 10 menit.
32
3.4.7.3 Proses inaktivasi endogen peroksidase
Meneteskan H
2
O
2
3 pada setiap preparat sampai seluruh permukaan potongan organ tertutup. Kemudian ditunggu selama 5 menit.
Preparat dicelupkan kembali kedalam toples berisi cairan PBS yang kemudian diputar selama 10 menit, kemudian dengan cairan PBS yang
baru preparat diputar kembali diatas Rotamax selama 5 menit.
3.4.7.4 Proses labeling
Meneteskan Labeling reaction mixture 50µl berisi 5µl TdT enzyme dicampurkan dengan 45 µl Labeling safe buffer pada setiap
preparat dan kemudian ditutup dengan cover glass. Preparat dimasukan kedalam wadah humidified chamber dan dioven dengan suhu 37
o
selama 70 menit. Setelah itu, preparat dikeluarkan dari oven dan dibuka cover
glassnya. Preparat kembali diletakkan pada rak, dan dicelupkan ke dalam toples berisi cairan PBS yang diputar diatas Rotamax sebanyak 2 kali
dengan PBS yang berbeda masing-masing selama 5 menit.
3.4.7.5 Proses Reaksi Antibody
Meneteskan anti-FITC HRP conjugate sebanyak 70 µl pada masing-masing preparat dan ditutup dengan cover glass. Preparat
dimasukan ke dalam oven dengan suhu 37
o
selama 30 menit. Selanjutnya membuka cover glass, dan preparat dicelupkan ke dalam toples berisi
cairan PBS yang kemudian diputar diatas Rotamax sebanyak 2 kali dengan PBS yang berbeda masing-masing selama 5 menit.
3.4.7.6 Proses pengembangan warna
Preparat dimasukan dalam toples berisi diaminobenzidine DAB dan diletakkan diatas rotamax selama 12 menit. Kemudian preparat
dicelupkan ke dalam toples berisi Deionized water yang kemudian diputar diatas rotamax sebanyak 2 kali dengan Deionized water yang
berbeda masing-masing selama 5 menit.
