Desain Penelitian Pengolahan dan Analisa Data

30  Ethanol  Ether  Buffer Sitrat  Streotozotocin STZ  Entellan  Deionized water  Kit pewarnaan Tunel

3.4.3 Adaptasi Hewan Sampel

Sebelum dilakukan percobaan, dilakukan tahap adaptasi pada semua hewan sampel di laboratorium Animal House selama 2 minggu. Hewan diadaptasikan dengan lingkungan barunya, makanan dan minumannya disamakan semua. Tujuan dari proses ini adalah untuk mengkondisikan semua tikus dalam kondisi yang sama sebelum diberikan perlakuan.

3.4.4 Induksi Streptozotocin STZ

Setelah dilakukan proses adaptasi, pada hari ke-15 tikus diinduksi STZ 55 mgkgbb secara intraperitoneal. Setelah hewan diinduksi STZ, selanjutnya diberi sukrosa 10 dalam waktu 24 jam untuk mencegah hipoglikemia. Pengukuran kadar gula darah dilakukan 4 hari setelah induksi STZ. Tikus dengan glukosa 250 mgdl dikatakan sebagai tikus DM.

3.4.5 Pemberian Ekstrak Kayu Manis Terhadap Tikus

Pada tikus yang telah DM, kelompok tikus uji diberikan terapi ekstrak kayu manis 200 mgkgBB peroral dengan menggunakan alat sonde. Pemberian ini dilakukan sekali dalam sehari selama 28 hari. 3.4.6 Tahap Sacrifice Pembedahan Setelah perlakuan selesai, semua tikus disacrifice dengan memasukkan tikus kedalam toples yang berisi kapas yang diberi ether sampai tidak berespon ketika diberi rangsangan, kemudian tikus dibedah untuk diambil jantungnya dan difiksasi dengan formalin 10. Kemudian dilakukan pembuatan sediaan 31 mikroskopis dengan metode paraffin. Pembuatan sediaan mikroskopis ini dilakukan di Departemen Histologi Universitas Indonesia, Salemba.

3.4.7 Tahap pewarnaan Tunel

Pada penelitian ini dilakukan pewarnaan TdT-mediated dUTP nick end- labeling TUNEL untuk dapat mengidentifikasi apoptosis sel pada masing- masing kelompok. Kit pewarnaan TUNEL yang digunakan adalah Takara bio. pada setiap kelompok diambil 2 sampel pada kelompok normal dan 3 sampel pada kelompok D dan D+Cc untuk dijadikan dilakukan pewarnaan. Tahap pewarnaan Tunel Takara bio sebagai berikut:

3.4.7.1 Deparafinisasi

Preparat mikroskopis yang telah siap, diletakan pada rak preparat, dan kemudian dicelupkan secara berurutan kedalam 3 toples yang berisi cairan xylene I, xylene II, dan xylene III dengan cara bergantian masing- masing selama 5 menit. Pada saat pencelupan, toples diletakkan diatas Rotamax dengan pengaturan kecepatan ±125 rpm. Setiap sebelum diputar dengan Rotamax preparat diangkat celup sebanyak 3 kali terlebih dahulu. Selanjunya preparat dicelupkan secara berurutan kedalam toples yang berisi cairan ethanol 100, ethanol 100, ethanol 90, dan ethanol 70 masing-masing selama 5 menit. Setiap pencelupan, toples diletakkan juga diatas Rotamax dengan pengaturan kecepatan ±125 rpm. Preparat kemudian dicelupkan ke dalam toples berisi DW dan diletakkan diatas Rotamax selama 2 menit.

3.4.7.2 Proses Enzimatik

Mengeringkan dan meletakkan preparat secara berjajar diatas alas. Kemudian meneteskan Proteinase K sebanyak 10-20 µgml dan didiamkan pada suhu ruangan selama 15 menit. Preparat diletakkan kembali pada rak preparat dan dicelupkan kedalam toples berisi cairan PBS yang selanjutnya diputar diatas Rotamax sebanyak 2 kali dengan PBS yang berbeda masing-masing selama 10 menit. 32

3.4.7.3 Proses inaktivasi endogen peroksidase

Meneteskan H 2 O 2 3 pada setiap preparat sampai seluruh permukaan potongan organ tertutup. Kemudian ditunggu selama 5 menit. Preparat dicelupkan kembali kedalam toples berisi cairan PBS yang kemudian diputar selama 10 menit, kemudian dengan cairan PBS yang baru preparat diputar kembali diatas Rotamax selama 5 menit.

3.4.7.4 Proses labeling

Meneteskan Labeling reaction mixture 50µl berisi 5µl TdT enzyme dicampurkan dengan 45 µl Labeling safe buffer pada setiap preparat dan kemudian ditutup dengan cover glass. Preparat dimasukan kedalam wadah humidified chamber dan dioven dengan suhu 37 o selama 70 menit. Setelah itu, preparat dikeluarkan dari oven dan dibuka cover glassnya. Preparat kembali diletakkan pada rak, dan dicelupkan ke dalam toples berisi cairan PBS yang diputar diatas Rotamax sebanyak 2 kali dengan PBS yang berbeda masing-masing selama 5 menit.

3.4.7.5 Proses Reaksi Antibody

Meneteskan anti-FITC HRP conjugate sebanyak 70 µl pada masing-masing preparat dan ditutup dengan cover glass. Preparat dimasukan ke dalam oven dengan suhu 37 o selama 30 menit. Selanjutnya membuka cover glass, dan preparat dicelupkan ke dalam toples berisi cairan PBS yang kemudian diputar diatas Rotamax sebanyak 2 kali dengan PBS yang berbeda masing-masing selama 5 menit.

3.4.7.6 Proses pengembangan warna

Preparat dimasukan dalam toples berisi diaminobenzidine DAB dan diletakkan diatas rotamax selama 12 menit. Kemudian preparat dicelupkan ke dalam toples berisi Deionized water yang kemudian diputar diatas rotamax sebanyak 2 kali dengan Deionized water yang berbeda masing-masing selama 5 menit. 33

3.4.7.7 Proses Counterstaining

Meneteskan methyl green 3 pada masing-masing preparat sampai seluruh permukaan potongan organ tertutup. Kemudian ditunggu sampai 7 menit. Kemudian preparat dicelupkan ke dalam toples berisi Deionized water dan diputar diatas rotamax selama 5 menit.

3.4.7.8 Proses dehidrasi preparat

Preparat diangkat-celupkan sebanyak 3 kali secara berurutan kedalam toples yang berisi cairan ethanol 70 , ethanol 90, ethanol 100, kemudian celupkan satu persatu preparat kedalam xylene dan dikeringkan.

3.4.7.9 Fiksasi preparat

Setelah preparat kering, kemudian teteskan Entelan diatas potongan organ preparat sebanyak 1 tetes dan ditutup dengan cover glass dan diperhatikan agar tidak terdapat gelembung udara. Preparat didiamkan minimal 12 jam.

3.4.8 Pengamatan Jaringan

Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop Olympus BX41 pada perbesaran 20x. Persentase apoptosis dihitung dengan menghitung jumlah total apoptosis dalam semua lapang pandang dalam satuan persen. 45

3.6 Pengolahan dan Analisa Data

Setelah dilakukan pengambilan data, selanjutnya data di olah dengan menggunakan program SPSS versi 16.0. Uji yang digunakan adalah Uji Oneway Anova karena penelitian ini termasuk analitik kategorik numerik, yang membandingkan variabel dengan skala pengukuran numerik pada lebih dari dua kelompok yang tidak berpasangan. Untuk melakukan uji Oneway Anova, terlebih dahulu dilakukan uji normalitas data dan uji homogenitas. Hasil menunjukkan 34 signifikan apabila nilai P0,05. Kemudian untuk mengetahui perbandingan antar kelompok, dilakukan uji Post hoc dan hasil dikatakan signifikan terdapat perbedaan apabila P0,05. 35

3.5 Alur Penelitian

Tikus tiba di laboraturium Animal House Adaptasi hewan sampel selama 14 hari Pembagian kelompok Kontrol Negatif Kelompok Normal N, dengan gula darah 250 mgdl Tikus diinduksi dengan STZ 55 mgkgbb pada hari ke 15 Kontrol positif Kelompok DM D, dengan gula darah 250 mgdl Perlakuan Kelompok D+Cc 200 mgkgBB DM dengan Cinnamomum cassia dosis 200 mgKgBB Sacrifice Pembiusan dengan menggunakan ether, pembedahan dan pengambilan organ jantung tikus Pembuatan preparat Pembuatan sediaan mikroskopik dengan metode paraffin di Departemen Histologi UI Pewarnaan preparat Pewarnaan preparat dilakukan sesuai dengan protocol TUNEL TdT-mediated dUTP Nick End.Labelling TAKARA Identifikasi miksroskop Penghitungan Sampel Preparat Sampel TUNEL dibaca secara kuantitatif dengan menghitung persen apoptosis Analisa Statistik data Perizinan kode etik hewan coba 36

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil dan Pembahasan

Hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Rachmah dkk. 2015, didapatkan data glukosa darah yang merupakan jumlah rata-rata glukosa darah pada awal penelitian hari ke-1, yaitu saat tikus dinyatakan DM dan normal, hari ke-7, hari ke- 14, hari ke-21 dan hari ke-28. Data yang didapatkan selama penelitian adalah : Tabel 4.1 Rata-rata dan standar deviasi glukosa darah tikus setiap kelompok penelitian GDS Mean±SD mgdl Kelompok Hari-1 Hari-7 Hari-14 Hari-21 Hari-28 N 83.3±10.5 116.8±12 94.3±17.3 117.5±12.6 103.3±7.5 D 481.3±98.2 532.8±91.2 521±102.4 531.5±26.3 600±0 D+CC 200 503.3±134.3 441.3±203.8 460.3±235.2 426.5±241.3 479.3±221.9 Ket: SD = Standard Deviasi, N = Normal n=2, D = Diabetesn=3, D+Cc200 = Diabetes dengan terapi kayu manis 200mgkgBB n=3, D+ Cc400= Diabetes dengan terapi kayu manis 400 mgkgBB. P0,05 dibandingkan N, P0,05 dibandingkan D. 39 Kemudian data apoptosis sel yang diambil pada penelitian adalah jumlah rerata dari sel yang mengalami apoptosis pada semua lapang pandang yang didapatkan pada setiap preparat jantung tikus masing-masing kelompok. Kelompok normal N yang menjadi kontrol negatif, kelompok tikus diabetes D yang merupakan kontrol positif, dan kelompok perlakuan terapi kayu manis D + Cc yaitu kelompok tikus diabetes yang diberikan terapi ekstrak Cinnamomum cassia 200 mgkgBB selama 28 hari. Dimana preparat tersebut telah dilakukan pewarnaan dengan menggunakan pewarnaan TUNEL yang dapat mengidentifikasi apoptosis sel. Data yang didapatkan selama penelitian adalah : 37 Grafik 4.1 Rerata persentase jumlah apoptosis sel jantung pada semua kelompok penelitian. N = Normal n=2, D = Diabetes n=3, D+Cc200= Diabetes dengan terapi kayu manis 200 mgkgBB n=3. P0,05, P0,01 untuk N vs D, P0,05, P0,01 untuntuk D vs D+Cc. Berdasarkan hasil yang didapati pada grafik 4.1 menunjukkan bahwa rerata persentase apoptosis sel jantung pada sampel normal, menunjukkan hasil yang rendah 15. Sedangkan pada sampel diabetes, hasil memperlihatkan kenaikan jumlah rerata persentase apoptosis sel jantung sebanyak 61. Kemudian pada sampel perlakuan terapi C. cassia 200 mgkgBB D + Cc menunjukkan nilai yang rendah yaitu 12. Pada hal ini memperlihatkan bahwa jumlah rerata apoptosis sel jantung pada sampel D + Cc lebih rendah jika dibandingkan dengan sampel diabetes. Namun, jumlah rerata sampel D + Cc hampir setara dengan sampel normal walaupun persentasenya berselisih 3 dengan sampel D + Cc yang relatif lebih rendah. Selanjutnya perbedaan persentase apoptosis sel jantung yang telah didapat diuji secara statistik dengan menggunakan Oneway Annova. Setelah dipastikan distribusi data persentase apoptosis sel jantung ini normal, dan juga varian datanya heterogen. Uji Oneway Annova yang didapatkan p-value 0,001, yang berarti bahwa terdapat perbedaan jumlah persentase apoptosis sel jantung yang bermakna diantara semua kelompok penelitian Tabel 4.1. 10 20 30 40 50 60 70 80 R er at a Per se A popt osi s Sel J ant ung R er at a Per se nt as e A popt osi s Sel J ant ung N D D + Cc 38 Tabel 4.2 Hasil analisis Uji Oneway Annova Kelompok Mean±SD P value N 0,15±0,045 D 0,61±0,096 0,001 D + Cc 0,12±0,48 Ket: SD = Standard deviasi, N = Normal n=2, D = Diabetes n=3, D+Cc200 = Diabetes dengan terapi kayu manis 200 mgkgBB n=3. Kemudian untuk melihat rata-rata perbedaan sampel pada dua kelompok penelitian dilakukan uji analisis Post-hoc LSD. Uji Post-hoc LSD dapat dilakukan setelah mendapat uji Oneway Annova. Tabel 4.3 Hasil analisis Uji Post-hoc LSD Sampel Perbedaan Rerata CI 95 P value Minimum Maksimum N vs D -46,50 -63,04 -29,96 0,001 N vs D+Cc 2,50 -14,04 19,04 0,714 D vs D+Cc 49,00 34,20 63,80 0,001 Ket: CI= Confident Interval, N = Normal n=2, D = Diabetes n=3, D+Cc200 = Diabetes dengan terapi kayu manis 200 mgkgBB n=3 Hasil uji statistik menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan pada nilai rata-rata persentase jumlah apoptosis sel jantung pada sampel normal dengan sampel diabetes p value= 0,001, yang berarti bahwa terjadi peningkatan signifikan apoptosis sel jantung pada sampel diabetes jika dibandingkan sampel normal. Selanjutnya perbandingan sampel diabetes dengan perlakuan kayu manis 200 mgkgBB p value 0,001 menunjukkan penurunan jumlah apoptosis sel jantung yang signifikan pada sampel kayu manis jika dibandingkan diabetes. Sementara itu, tidak terdapat perbedaan rata-rata persentase jumlah apoptosis sel jantung pada sampel normal dengan sampel kayu manis 200 mgkgBB p value = 0,714.