Hipotesis Jenis dan Rancangan Penelitian Penyiapan Bahan, Penyerbukan dan Susut Pengeringan Serbuk

polifenolik, flavonoid yang dapat memberikan aktivitas farmakologis. Seiring dengan berkembangnya kosmetik tradisional, semakin banyak pula kosmetik yang beredar di pasaran dengan komposisi bahan herbal salah saatunya adalah masker wajah ekstrak daun pegagan yang diklaim dapat memperhalus kulit wajah dan sebagai masker merawat kulit wajah yang berjerawat. Aktivitas antioksidan, UV protection, dan antibakteri dilakukan untuk menguji kandungan senyawa apa yang berperan aktif dalam memberikan aktivitas tersebut dalam ektstrak etanolik daun pegagan, dengan demikian untuk mengetahui kandungan senyawa dilakukan pengecekan menggunakan kromatografi lapis tipis sehingga senyawa bioaktif dapat terpisah menjadi beberapa komponen berdasarkan sifat polaritasnya. Penelitian yang dilakukan ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang manfaat tanaman pegagan terutama bagian daunnya terkait aktivitasnya sebagai penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri.

K. Hipotesis

Daun pegagan mengandung senyawa kimia terpenoid, flavonoid, fenolik, dan minyak atsiri yang dapat memberikan aktivitas penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri. 21 BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksploratif. Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognogsi-Fitokimia dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

B. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah simplisia kering daun pegagan sebanyak 1 kg yang didapatkan dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional B2P2TOOT Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah. Bahan kimia yang digunakan berupa bahan kualitas pro analitik Sigma hem. Co., USA yaitu DPPH dan β-karoten. Pelarut kualitias pro analitik dari Merck, yaitu kloroform, etanol, metanol, n- heksana, etil asetat, asam formiat, dan asam asetat glasial. TLC silica gel 60 F 254 dan silica gel 60 0,040-0,063 dari Merck. Bahan kualitas teknis dari Brataco Chemica yaitu ethanol 96 vv ethanol 96 vv antiseptik, dan aquadest. Kultur bakteri uji S. aureus, E. coli, media pertumbuhan bakteri berupa Mueller Hinton Agar MHA dari Merck didapat dari Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta. Media pertumbuhan bakteri Trypticasein Soy Broth TSB dan Oxoide Agar dari PT. Agarindo Biological Company, Indonesia. Antibiotik yaitu Amoxicilin dari PT. Indofarma.

2. Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah vortex Junke Kunkel, rotary vacuum evaporator Buchi Labortechnik AG CH-9230, waterbath Memmert, mikropipet 10- 1000 μL; 1-10 mL Acura 825, Socorex, timbangan analitik digital Scaltec SBC 22, BP 160P, autoclave YX – 400Z, oven WTE binder, cawan petri, cawan porselin, sendok, bunsen, jarum ose, tabung kaca, mikrotube, pipa kapiler Brand, corong, kain mori, kertas saring no. 41 Whatman, tabung reaksi bertutup dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis Pyrex-Germany dan Iwaki.

C. Tata Cara Penelitian

1. Alur pengerjaan penelitian

Gambar 2. Bagan alur pengerjaan penelitian Pembelian bahan Pembuatan serbuk simplisia Ekstrak kental Susut pengeringan serbuk simplisia Ekstraksi  Maserasi menggunakan etanol 90 vv  evaporasi Uji kualitatif aktivitas Uji kualitatif aktivitas pada isolat Isolasi senyawa aktif Uji aktivitas penangkap radikal bebas menggunakan metode DPPH Identifikasi golongan senyawa aktif isolat secara kualitatif menggunakan reagen semprot Susut pengeringan ekstrak kental Uji aktivitas UV protection metode inhibition of bleaching of β-caroten Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode bioautografi Uji aktivitas penangkap radikal bebas menggunakan metode DPPH Uji aktivitas UV protection metode inhibition of bleaching of β-caroten Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode bioautografi

2. Penyiapan simplisia

Bahan penelitian yang digunakan yaitu bagian daun pegagan yang sudah kering sebanyak 1 kg yang didapatkan dari B2P2TOOT dan sudah dideterminasi. Simplisia kering disortasi kering untuk menghilangkan pengotor yang ada, kemudian dihaluskan kasar menggunakan blender.

3. Perhitungan susut pengeringan simplisia

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 1 g menggunakan cawan petri. cawan petri yang berisi serbuk simplisia ditimbang sebagai berat pada waktu 0 menit. Panaskan menggunakan oven dengan suhu 105 ℃ tiap 30 menit kemudian didiamkan pada desikator selama 10 menit dilakukan sampai memperoleh bobot tetap. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali.

4. Ekstraksi

Serbuk simplisia yang akan diekstraksi ditimbang sebanyak 50 g kemudian, dimasukkan dalam erlenmeyer yang sudah berisi etanol 90 vv dengan perbandingan 1:3 atau sampai semua serbuk terendam sempurna dengan etanol setinggi 2 cm. Tutup erlenmeyer menggunakan aluminium foil, kemudian dilakukan ekstraksi dengan penggojogan yang konstan menggunakan maserator selama 24 jam. Setelah 24 jam, dilakukan penyaringan menggunakan kain mori. Ampas yang tersisa, dimaserasi kembali dengan perlakuan yang sama. Kedua filtrat yang didapat dicampur dan saring menggunakan kertas saring yang akan dilanjutkan dengan pemekatan ekstrak menggunakan evaporator bersuhu 60 ℃.

5. Susut pengeringan ekstrak

Ekstrak kental ditimbang sebanyak 1 g menggunakan cawan petri yang sudah ditimbang berat kosongnya. Cawan petri yang berisi ekstrak kental ditimbang sebagai berat pada waktu 0 menit. Panaskan menggunakan oven dengan suhu 105 ℃ tiap 30 menit kemudian didiamkan pada desikator selama 10 menit dilakukan sampai memperoleh bobot tetap. Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali.

6. Uji kualitatif golongan senyawa

a. Optimasi fase gerak

Berbagai macam fase gerak dibuat dengan perbandingan : 1 n-heksana : etil asetat 2:3 vv 2 kloroform : metanol 7:3 vv 3 kloroform : metanol 9:1 vv 4 kloroform : metanol 95:5 vv 5 etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air 100:11:11:20 vv Larutan ekstrak dibuat dengan konsentrasi 5 mgmL dari ekstrak kental dan pastikan ekstrak telah larut sempurna. Larutan ekstrak tersebut ditotolkan pada sebuah pelat KLT dengan jarak elusi 5 cm. Pelat KLT dimasukkan ke dalam chamber fase gerak yang sudah dijenuhkan menggunakan kertas saring. Pelat KLT dibuat sejumlah fase gerak yang akan dioptimasi. Nilai Rf tiap spot senyawa yang muncul dihitung.

b. Uji kualitatif golongan senyawa

Enam buah pelat KLT yang sudah dielusi dibiarkan beberapa saat untuk menghilangkan pelarut fase gerak yang masih tersisa pada pelat KLT. Satu buah pelat KLT dilihat dibawah lampu UV 254 nm dan 360 nm beri tanda pada spot pemisahan yang meredam atau berpendar. Lima buah pelat disemprotkan pelat KLT tersebut dengan reagen semprot : 1 AlCl 3 2 FeCl 3 3 Dragendroff 4 Vanilin-asam sulfat 5 Sitroborat Nilai Rf tiap spot senyawa yang muncul dihitung.

7. Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas ekstrak dan isolat

Pelat KLT disiapkan untuk pengujian, totolkan larutan ekstrak konsentrasi 5 mgmL dan isolat konsentrasi 1 mgmL ditotolkan hingga mendapatkan mass loading 10 μg, 20 μg, dan 30 μg, kemudian dielusikan pada fase gerak yang sudah dipilih paling optimal. Satu buah pelat untuk kontrol dan satu buah untuk disemprotkan menggunakan larutan DPPH 0,25mg10mL metanol. Hitung nilai Rf pada spot pemisahan yang dapat menghambat DPPH dengan memberikan warna ungu yang memudar hingga kekuningan.

8. Optimasi ketinggian lampu UV dan waktu perlakuan

Pada rangkaian alat lampu UV dibuat untuk dapat digerakan naik turun sehingga dapat mengoptimasikan jarak lampu UV yang dapat merubah warna larutan �-karoten dan masih dapat terukur dengan jarak 100 cm dari dasar, 50 cm dari dasar, dan 35 cm dari dasar. Ditiap perbedaan ketinggian diukur intensitas cahaya lampu UV dengan alat lightmeter. Ditiap perbedaan ketinggian, pelat KLT yang sudah dicelupkan ke dalam larutan �-karoten dan dimasukkan ke dalam rangkaian alat dengan lampu UV yang menyala. Diukur perubahan warnanya menggunakan indikator warna tiap menit hingga 15 menit. Perubahan warna setiap diamati tiap 0, 1, 3, 6, 9, 12, dan 15 menit.

9. Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak dan isolat

Enam buah pelat KLT disiapkan, satu buah pelat untuk kontrol, lima buah pelat untuk perlakuan tiga kali replikasi pada ekstrak dan dua buah pelat untuk pengujian isolat yang tidak dilakukan replikasi. Larutan ekstrak ditotolkan dengan konsentrasi 5 mgmL dan isolat konsentrasi 1 mgmL ditotolkan hingga mendapatkan mass loading 10 μg, 20 μg, dan 30 μg, kemudian elusikan pada fase gerak yang paling optimal. Larutan �-karoten 0,5mgmL disiapkan dengan melarutkan �-karoten dalam kloroform. Lampu UV disiapkan dengan ketinggian optimal dan ukur intensitas cahaya yang dikeluarkan oleh lampu UV menggunakan lightmeter. Pelat KLT dicelupkan satu per satu kedalam larutan �-karoten dan dimasukkan pada rangkaian alat lampu UV selama 0, 1, 3, 6, 9, dan 12 menit tiap hitungan waktu dilihat perubahan warna yang terjadi menggunakan indikator skala warna. Nilai Rf pada spot pemisahan yang dapat mempertahankan warna orange kekuningan dihitung.

10. Uji kualitatif aktivitas antibakteri

Seluruh pekerjaan dilakukan secara aseptis menggunakan bunsen dan alkohol antiseptik.

a. Pembuatan media pertumbuhan

1 Media padat Triptic Soy Broth TSB ditimbang sebanyak 6 g dan agar sebanyak 2,4 g. TSB dilarutkan kedalam aquadest 300 mL sambil dipanaskan. Tambahakan agar sedikit demi sedikit hingga homogen dan campuran menjadi bening. Autoklaf selama 15 menit. Selagi masih panas, tuangkan media pada cawan petri yang sudah disterilisasi. 2 Media cair TSB ditimbang sebanyak 3 g dan larutkan kedalam erlenmeyer berisi aquadest 100 mL sambil dipanaskan. Aduk hingga homogen kemudian autoklaf selama 15 menit. Selagi panas pindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup.

b. Pengawetan bakteri

Koloni bakteri S. aureus dan E. coli yang masih segar dicuplik sebanyak satu goresan ose. Pindahkan kedalam tabung reaksi yang berisi media cair. Lakukan lagi hingga bakteri tidak tersisa. Inkubasi selama 24 jam pada inkubator suhu 37 ℃. Setelah diinkubasi, tabung reaksii yang berisi pertumbuhan bakteri divortex hingga homogen. 1000 μL kultur bakteri diambil dan dimasukkan ke dalam tabung eppendrof kemudian dimasukan gliserol 50 μL, lakukan hingga habis kemudian ditutup rapat. Kultur bakteri diinkubasi dalam inkubator selama 1 jam kemudian disimpan di freezer.

c. Pembuatan kultur bakteri uji

Satu tabung eppendrof berisi bakteri S. aureus dan satu tabung berisi bakteri E. coli disiapkan. Pada tabung reaksi yang berisi cairan fisiologis 0,9 sebanyak 10 mL ditambahkan koloni bakteri yang sudah siap tetes demi tetes hingga sama dengan MacFarland 0,5 yang setara dengan jumlah bakteri 1,5x10 8 CFU.

d. Perlakuan uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak menggunakan

metode bioautografi Pada cawan petri yang berisi media padat, digoreskan menggunakan cottonbud steril yang sudah dimasukkan dalam larutan bakteri uji yang sudah disiapkan secara merata keseluruh bagian. Tiga buah pelat KLT disiapkan dengan lebar 1 cm. dengan larutan ekstrak 5mgmL ditotolkan sebanyak 15 μL, 20 μL, 30 μL. Kemudian elusi menggunakan fase gerak yang optimal. Tunggu 30 menit untuk menghilangkan sisa pelarut fase gerak yang digunakan. Setelah semua siap, pelat KLT ditempelkan perlahan pada media padat dalam cawan petri yang sudah ditumbuhi bakteri. Setelah 45 menit, pelat KLT diambil, dan media padat diinkubasi selama 18 jam. Hasil positif adalah munculnya zona jernih pada spot pemisahan.

e. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat menggunakan metode disc

diffusion Larutan isolat disiapkan dengan konsentrasi 1mgmL. Diambil larutan isolat sebanyak 50 μL, 75 μL, dan 100 μL kemudian kering uapkan larutan tersebut pada paper disc blank. Media Muller Hilton yang sudah memadat diinokulasikan bakteri S. aureus dengan teknik streak hingga merata, kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Paper disc isolat yang sudah siap diinokulasikan pada media yang sudah ditumbuhi bakteri dan diinkubasi selama 24 jam. Amati zona jernih yang terbentuk dan diukur besar diameternya.

11. Isolasi senyawa aktif

a. Triturasi

Ekstrak kental dan seasand ditimbang sebanyak 5 g. Keduanya dicampurkan dengan cara digerus sambil ditetesi menggunakan metanol secukupnya untuk mempermudahkan homogenisasi dan diibiarkan satu malam untuk menghilangkan metanol yang ditambahkan. Campuran ekstrak dipindahkan ke dalam tube sentrifuge hingga tanda volume 1 kemudian ditambahkan pelarut n-heksana hingga tanda volume 3. Tube divortex hingga homogen kemudian disentrifuge selama 10 menit. Supernatant yang terbentuk diambil dan disaring, lalu diuapkan. Endapan yang tersisa pada tube dikeringkan lalu ditambahkan pelarut yang diganti dengan kloroform : metanol 95:5 vv, dan dilanjutkan dengan pelarut kloroform: metanol 9:1 vv.

b. Kromatografi kolom

Fraksi ekstrak dari hasil triturasi menggunakan pelarut kloroform : metanol 95:5 vv dicampurkan dengan serbuk silika gel masing-masing sebanyak 300 mg kemudian digerus hingga homogen. Packing kolom yang digunakan dengan urutan susunan : kapas, silika gel setinggi 2 cm, ekstrak setinggi 0,5 cm, silika gel setinggi 1 cm, dan tutup dengan kapas. Masukkan eluen secara bergradien menggunakan pelarut yang sesuai yaitu 10 mL n-heksana : kloroform 20:80 vv, 10 mL n-heksana : kloroform 10:90 vv, dan 20 mL kloroform, kemudian ditampung setiap 2 mL ke dalam tabung kaca. Isolat dipastikan kemurniannya menggunakan kromatografi lapis tipis. Isolat yang memiliki pola pemisahan yang sama digabungkan menjadi satu isolat, diuapkan, dan dihitung rendemen yang didapat. Isolat yang sudah kering, dipindahkan kedalam eppendrof sehingga terdapat 1 mg tiap eppendrof.

12. Alur pengerjaan isolasi senyawa aktif

Gambar 3. Bagan alur pengerjaan isolasi senyawa aktif Ekstrak kental Kromatografi kolom Isolat 2 Isolat 1 Fraksi CHCl 3 :MeOH 9:1vv Fraksi heksan Triturasi Fraksi CHCl 3 :MeOH 95:5vv 31 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian yang telah dilakukan ini secara umum bertujuan untuk mengetahui aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri pada ekstrak etanolik daun pegagan C. asiatica. Selain itu, untuk mempertegas aktivitas yang dimiliki maka penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi senyawa aktif dan mengetahui golongan senyawa aktif yang bertanggungjawab terhadap aktivitas yang diberikan dalam ekstrak etanolik daun pegagan.

A. Penyiapan Bahan, Penyerbukan dan Susut Pengeringan Serbuk

Simplisia Daun Pegagan Simplisia kering herba pegagan C. asiatica sebanyak 1 kg didapatkan dari B2P2TOOT, Tawangmangu, Jawa Tengah. Bahan yang digunakan untuk penelitian merupakan bagian daun dari tanaman pegagan. Sebelum diproses lebih lanjut, simplisia perlu dilakukan determinasi yang bertujuan untuk memastikan kebenaran tanaman yang akan digunakan. Pegagan adalah tanaman dari family Apiaceae yang memiliki ciri-ciri berupa terna menahun, batang menjalar dengan panjang 0,1-0,8 meter. Tidak berbatang, rizoma pendek, dan salur panjang. Daun dalam roset, jumlah 2-10 per roset, berbentuk ginjal, tepi beringgit-berigi, panjang 1-7 cm, lebar 1½-9 cm, panjang tangkai daun 1-50 cm. Simplisia kering herba pegagan diperoleh dari B2P2TOOT, Tawangmangu, Jawa Tengah dijadikan sebagai bahan penelitian dan sudah didukung kebenaran dari tanaman dengan adanya determinasi seperti yang dilampirkan pada Lampiran 3. Simplisia kering yang didapat masih dalam campuran herba sehingga perlu dilakukan sortasi kering yang bertujuan untuk menghilangkan bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan seperti akar dan tangkai daun, sehingga yang didapatkan hanya bagian daunnya saja. Penyerbukan dilakukan untuk memperkecil permukaan simplisia sehingga dapat memperbesar luas permukaan dan dapat mempermudah penyarian. Simplisia diserbuk kasar menggunakan blender dengan tujuan mengurangi tumbukan pada blender supaya memperkecil kemungkinan kerusakan senyawa kimia yang terkandung pada daun pegagan. Standarisasi serbuk simplisia kering yang dilakukan adalah susut pengeringan untuk mengetahui kandungan air yang terdapat dalam simplisia. Menurut Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia nomor : 661MENKESSKVII1998 tentang persyaratan obat tradisional, menetapkan bahwa kadar air serbuk atau simplisia tidak boleh lebih dari 10. Pelabelan yang tertera pada kemasan simplisia kering dari B2P2TOOT adalah 8,86. Hal tersebut memang sudah memenuhi persyaratan yang berlaku, akan tetapi untuk memastikan kadar air yang sebenarnya pada saat hendak diproses maka dilakukan susut pengeringan. Susut pengeringan ini perlu dilakukan untuk memastikan kandungan air dari simplisia kering yang dapat berubah pada saat proses penyimpanan. Susut pengeringan dilakukan dengan cara serbuk simplisia kering yang dipanaskan pada suhu 105 ℃ hingga memperoleh bobot tetap. Pada kondisi ini, diasumsikan bahwa air yang terkandung dalam simplisia sudah menguap secara keseluruhan sehingga dapat menggambarkan kandungan air yang ada. Pada penelitian dilakukan tiga kali replikasi pengukuran sehingga didapatkan rata-rata susut pengerinngan pada simplisia kering daun pegagan sebesar 9,46 bb. Dari hasil susut pengeringan yang diperoleh serbuk simplisia daun pegagan masih memenuhi persyaratan kadar air yang sudah ditetapkan.

B. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Pegagan