Isolasi dan identifikasi senyawa aktif penangkap radikal bebas dpph, uv protection, dan antibakteri ekstrak bunga kenanga (cananga odorata (lmk.) Hook.F.

Bunga kenanga (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F. & Thoms.) adalah salah satu tanaman tradisional khas Indonesia yang digunakan sebagai bahan kosmetik tradisional. Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa aktif pada ekstrak bunga kenanga yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas 2,2-diphenyl-1-picrylhdrazyl (DPPH), UV protection, dan antibakteri.

Bunga kenanga diekstraksi dengan pelarut etanol 90% v/v kemudian dipekatkan hingga membentuk ekstrak. Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan pada ekstrak bunga kenanga menggunakan fase gerak optimum kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan fase diam silika gel 60 F254. Selanjutnya, dilakukan isolasi senyawa aktif yang dipandu dengan uji aktivitas penangkap radikal DPPH, UV protection dengan metode inhibition of bleaching of

�-carotene, dan antibakteri dengan metode bioautografi kontak. Isolasi senyawa aktif dilakukan dengan kromatografi kolom. Isolat diuji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection dengan metode inhibition of bleaching of �-carotene, dan antibakteri dengan metode disc diffusion. Selanjutnya dilakukan uji identifikasi dengan menggunakan berbagai reagen semprot pada isolat aktif.

Dengan kromatografi kolom, didapatkan hasil 3 isolat. Isolat 1 memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH dan antibakteri. Isolat 2 dan isolat 3 memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 merupakan senyawa golongan terpenoid. Kata kunci: Bunga kenanga (Cananga odorata), penangkap radikal bebas, UV protection, antibakteri.

Ylang-ylang or Cananga flower (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F. & Thoms.) is used to be Indonesia traditional cosmetic ingredients. This research aimed to isolate and identify active compounds in cananga flower extract that has a free radical scavenging activity 2,2-diphenyl-1-picrylhdrazyl (DPPH), UV protection, and antibacterial.

Cananga flowers extracted using ethanol 90% v/v, then evaporated to form the extract. Extracts of cananga flower separated in the thin layer chromatography (TLC) using optimum mobile phase chloroform : methanol (95: 5 v/v) and stationary phase silica gel 60 F254. The isolation of the active compound guided to DPPH radical scavenging activity test, UV protection with inhibition of bleaching of β-carotene method, and antibacterial with contact bioautografi method. Isolation of active compounds performed by column chromatography. Isolates tested qualitatively using DPPH free radical scavenging activity, UV protection with inhibition of bleaching of β-carotene method, and antibacterial with disc diffusion method. The active isolates was identified using various reagent.

By column chromatography showed 3 isolates. Isolate 1 has DPPH free radical scavenging activity and antibacterial activity. Isolate 2 and isolate 3 have DPPH free radical scavenging activity, UV protection activity, and antibacterial activity. The result showed that isolate 1, isolate 2 and isolate 3 were terpenoid compounds.

Keyword: Cananga flower (Cananga odorata), free radical scavengers, UV protection, antibacterial.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS DPPH, UV PROTECTION, DAN ANTIBAKTERI

EKSTRAK BUNGA KENANGA (Cananga odorata (Lmk.)Hook.F. & Thoms.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Surya Adhi Nugraha

NIM: 118114003

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

i

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS DPPH, UV PROTECTION, DAN ANTIBAKTERI

EKSTRAK BUNGA KENANGA (Cananga odorata (Lmk.)Hook.F. & Thoms.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Surya Adhi Nugraha

NIM: 118114003

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

ii

Persetujuan Pembimbing

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS DPPH, UV PROTECTION, DAN ANTIBAKTERI

EKSTRAK BUNGA KENANGA (Cananga odorata (Lmk.)Hook.F. & Thoms.)

Skripsi yang diajukan oleh :

Surya Adhi Nugraha

NIM: 118114003

telah disetujui oleh

Pembimbing Utama

iii

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“ When I was 5 years old, my mother always told me that happiness was the key to life. When I went to school, they asked me what I wanted to be when I

grew up. I wrote down “happy”. They told me I didn’t understand the assignment, and I told them they didn’t understand life”

John Lennon

Kupersembahkan Skripsi ini untuk: Tuhan yang selalu mendampingi dan memberi kekuatan Keluargaku yang selalu memberikan dukungan Agustine Kurniawaty yang selalu memberikan keceriaan dan dukungan

v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang -

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 19 Juni 2015

Penulis

vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

Nama : Surya Adhi Nugraha

Nomor Mahasiswa : 118114003

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya berjudul:

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS DPPH, UV PROTECTION, DAN ANTIBAKTERI EKSTRAK BUNGA KENANGA (CANANGA ODORATA (LMK.) HOOK.F. & THOMS.)

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama saya tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis. Dengan demikian peryataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 2 Agustus 2015 Yang menyatakan

vii PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan karena atas berkat dan rahmat-Nya penulis

dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Senyawa Aktif Penangkap Radikal Bebas DPPH, UV Protection, dan Antibakteri Ekstrak Bunga Kenanga (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F. & Thoms.)” sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farnasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

Proses penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan

dukungan dari berbagai pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan

baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan

terimakasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Dr.rer.nat. Yosi Bayu Murti, Apt. sebagai Dosen Pembimbing yang telah

memberikan bimbingan, arahan serta ilmu dalam penelitian dan

penyusunan skripsi ini.

2. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. sebagai Dosen Penguji atas kritik, saran

dan kesediaannya menguji skripsi ini.

3. Damiana Sapta Candrasari, S.Si, M.Sc. sebagai Dosen Penguji atas kritik,

saran dan kesediaannya menguji skripsi ini.

4. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi

viii

5. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma.

6. Agustine Kurniawaty, Setio Agustin, Elyn Prameswari dan Skolastika

Feranda Wardani atas kerjasama yang telah kita lewati selama proses

penelitian dan penyusunan skripsi.

7. Teman- teman angkatan 2011, atas kerjasama, doa, semangat, kritik dan

sarannya.

8. Semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan yang tidak

dapat disebutkan satu per satu.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini banyak kesalahan

dan kekurangan mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis.

Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari berbagai

pihak. Akhir kata semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi

perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi.

Yogyakarta, Juni 2015

ix DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL………i

PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii

HALAMAN PENGESAHAN ... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... v

LEMBAR PERYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA S ... vi

PRAKATA ... vii

DAFTAR TABEL ... xiv

DAFTAR GAMBAR ... xvii

DAFTAR LAMPIRAN ... xix

INTISARI ... xxi

ABSTRACT ... xxii

BAB I PENGANTAR ... 1

A. Latar Belakang ... 1

1. Permasalahan... 3

2. Keaslian penelitian ... 3

x

B. Tujuan ... 5

1. Tujuan umum ... 5

2. Tujuan khusus ... 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA... 6

A. Kenanga... 6

1. Klasifikasi tanaman ... 6

1. Deskripsi tanaman kenanga... 7

2. Kandungan kimia kenanga ... 7

B. Ekstraksi ... 8

C. Antioksidan ... 8

1. Definisi antioksidan ... 8

2. Metode penangkapan radikal DPPH ... 9

D. UV Protection ... 10

1. Definisi UV protection ... 10

2. Metode inhibition of bleaching of �-carotene ... 11

E. Antibakteri... 12

1. Definisi antibakteri ... 12

2. Metode bioautografi ... 12

3. Metode difusi ... 13

xi

1. Kromatografi lapis tipis (KLT) ... 13

2. Kromatografi kolom ... 15

G. Keterangan Empiris ... 15

BAB III METODE PENELITIAN... 16

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 16

B. Bahan dan Materi Penelitian ... 16

1. Bahan penelitian ... 16

2. Alat penelitian ... 17

C. Tata Cara Penelitian ... 17

1. Determinasi sampel ... 17

2. Pengumpulan dan penyiapan bahan ... 17

3. Ekstraksi ... 19

4. Kromatografi lapis tipis ekstrak ... 20

5. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH ... 21

6. Uji kualitatif aktivitas UV protection ... 21

7. Uji kualitatif aktivitas antibakteri... 22

8. Identifikasi golongan senyawa ekstrak ... 25

9. Pembersihan klorofil dengan karbon aktif ... 25

10. Kromatografi kolom ... 25

xii

12. Uji kualitatif aktivitas UV protection isolat ... 28

13. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat ... 28

14. Identifikasi golongan senyawa isolat ... 30

15. Bagan alur penelitian... 31

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 32

A. Determinasi Sampel ... 32

B. Pengumpulan dan Penyiapan Bahan ... 32

C. Ekstraksi ... 34

1. Ekstraksi bunga kenanga ... 34

2. Susut pengeringan simplisia dan ekstrak bunga kenanga (C. odorata) . 35 3. Pemerian ekstrak bunga kenanga ... 37

D. Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak ... 37

E. Uji Kualitatif Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas DPPH ... 40

F. Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection ... 43

G. Uji Kualitatif Aktivitas Antibakteri Metode Bioautografi ... 47

H. Identifikasi Golongan Senyawa Ekstrak ... 49

I. Penghilangan Klorofil Ekstrak Bunga Kenanga dengan Karbon Aktif . 51 J. Kromatografi Kolom ... 54

xiii

L. Hasil Uji Kualitatif Penangkapan Radikal Bebas DPPH Isolat 1, Isolat 2,

dan Isolat 3 ... 62

M. Uji Kualitatif UV Protection Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3 ... 64

N. Uji Kualitatif Antibakteri Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3 ... 65

O. Hasil Identifikasi Golongan Senyawa Isolat 1, Isolat 2, dan Isolat 3 .... 66

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 71

A. Kesimpulan ... 71

B. Saran ... 71

DAFTAR PUSTAKA ... 72

LAMPIRAN ... 76

xiv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak

bunga kenanga dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v)

... 38

Tabel II. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak

bunga kenanga dengan fase gerak etil asetat:asam formiat: asam

asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v) ... 38

Tabel III. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak

bunga kenanga dengan fase gerak kloroform : metanol (7 : 3 v/v) 38

Tabel IV. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak

bunga kenanga dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

... 40

Tabel V. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak

kloroform:metanol (95 : 5 v/v) ... 42

Tabel VI. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak

etil asetat: asam formiat: asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v)

... 42

Tabel VII. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak

n-heksana: etil asetat (2:3 v/v) ... 42

xv

Tabel IX. Hasil uji kualitatif aktivitas antibakteri dengan bakteri S. aureus .. 47 Tabel X. Hasil uji kualitatif aktivitas antibakteri dengan bakteri E. coli ... 48 Tabel XI. Hasil identifikasi golongan senyawa hasil pemisahan ekstrak pada

berbagai reagen ... 50

Tabel XII. Optimasi fase gerak kromatografi kolom ... 56

Tabel XIII. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 1 dengan fase gerak

n-heksana : kloroform (50 : 50 v/v) ... 58

Tabel XIV. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 2 dengan fase gerak

n-heksana : kloroform (50 : 50 v/v) ... 59

Tabel XV. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 3 dengan fase gerak

n-heksana : kloroform (50 : 50 v/v) ... 59

Tabel XVI. Penggabungan isolat hasil kromatografi kolom ... 60

Tabel XVII. Hasil deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada UV 254 nm dan UV

366 nm pada sistem fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) ...

... 61

Tabel XVIII. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal bebas DPPH ekstrak, isolat

1, isolat 2, dan isolat 3 ... 63

Tabel XIX. Hasil uji kualitatif UV protection ekstrak, isolat 1, isolat 2, dan

isolat 3 pada menit ke 15 ... 64

Tabel XX. Hasil uji kualitatif antibakteri amoksisilin, isolat 1, isolat 2, dan

xvi

Tabel XXI. Hasil identifikasi golongan senyawa isolat 1, isolat 2, dan isolat 3

pada berbagai reagen ... 68

Tabel XXII. Rangkuman hasil uji kualitatif isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 ... 69

xvii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Reaksi DPPH dengan radical scavengers ... 10 Gambar 2. Struktur senyawa β-karoten ... 12 Gambar 3. Hasil optimasi fase gerak kromatografi lapis tipis ekstrak kenanga .

... 38

Gambar 4. Hasil optimasi fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)... 39

Gambar 5. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH ... 41

Gambar 6. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH pada fase

gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) ... 41

Gambar 7. Optimasi intensitas sinar UV ... 44

Gambar 8. Hasil uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak pada menit ke 15 ... 45

Gambar 9. Hasil uji bioautografi ... 47

Gambar 10. Hasil identifikasi golongan senyawa hasil pemisahan ekstrak pada

berbagai reagen semprot ... 49

Gambar 11. Reaksi antara alumunium chloride dengan senyawa flavonoid membentuk kompleks senyawa yang berfluoresensi lebih terang. . 51

Gambar 12. Hasil penghilangan klorofil dengan karbon aktif ... 52

xviii

Gambar 14. Pengecekan hasil kromatografi kolom proses 1 menggunakan fase

gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) ... 57

Gambar 15. Deteksi isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 pada UV 254 nm dan UV

366 nm ... 61

Gambar 16. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal DPPH isolat 1, isolat 2, dan

isolat 3... 62

Gambar 17. Hasil uji kualitatif UV protection isolat1, isolat 2, dan isolat 3 ... 65 Gambar 18. Hasil identifikasi isolat 1 pada berbagai reagen ... 67

Gambar 19. Hasil identifikasi isolat 2 pada berbagai reagen ... 67

xix

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi bunga kenanga (C. odorata) ... 76 Lampiran 2. Gambar sampel penelitian yang digunakan ... 77

Lampiran 3. Perhitungan rendemen ekstraksi ... 78

Lampiran 4. Perhitungan susut pengeringan simplisia bunga kenanga ... 79

Lampiran 5. Perhitungan susut pengeringan ekstrak bunga kenanga ... 81

Lampiran 6. Penguapan air pada ekstrak bunga kenanga dengan perlakuan 1

kilogram batu gamping ... 84

Lampiran 7. Penimbangan ekstrak bunga kenanga untuk kromatografi lapis tipis

(KLT) ... 85

Lampiran 8. Gambar parameter warna yang digunakan dalam uji kualitatif UV

protection ... 86 Lampiran 9. Optimasi intensitas Sinar UV ... 87

Lampiran 10. Sertifikat hasil uji bakteri ... 88

Lampiran 11. Gambar kontrol uji kualitatif antibakteri pada metode bioautografi

... 90

Lampiran 12. Data penimbangan pada tahap penghilangan klorofil ... 91

xx

Lampiran 14. Data penimbangan pada tahap kromatografi kolom gradien

... 93

Lampiran 15. Hasil Uji Kualitatif UV protection isolat 1, isolat 2, isolat 3 pada

menit ke 15 ... 94

Lampiran 16. Kontrol kontaminasi media dan kontrol pertumbuhan bakteri S. aureus pada metode disk diffusion ... 96 Lampiran 17.Gambar uji kualitatif antibakteri pada metode disk diffusion dengan

xxi INTISARI

Bunga kenanga (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F. & Thoms.) adalah salah satu tanaman tradisional khas Indonesia yang digunakan sebagai bahan kosmetik tradisional. Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa aktif pada ekstrak bunga kenanga yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas 2,2-diphenyl-1-picrylhdrazyl (DPPH), UV protection, dan antibakteri.

Bunga kenanga diekstraksi dengan pelarut etanol 90% v/v kemudian dipekatkan hingga membentuk ekstrak. Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan pada ekstrak bunga kenanga menggunakan fase gerak optimum kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan fase diam silika gel 60 F254. Selanjutnya, dilakukan isolasi senyawa aktif yang dipandu dengan uji aktivitas penangkap radikal DPPH, UV protection dengan metode inhibition of bleaching of �-carotene, dan antibakteri dengan metode bioautografi kontak. Isolasi senyawa aktif dilakukan dengan kromatografi kolom. Isolat diuji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection dengan metode inhibition of bleaching of � -carotene, dan antibakteri dengan metode disc diffusion. Selanjutnya dilakukan uji identifikasi dengan menggunakan berbagai reagen semprot pada isolat aktif.

Dengan kromatografi kolom, didapatkan hasil 3 isolat. Isolat 1 memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH dan antibakteri. Isolat 2 dan isolat 3 memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa isolat 1, isolat 2, dan isolat 3 merupakan senyawa golongan terpenoid.

Kata kunci: Bunga kenanga (Cananga odorata), penangkap radikal bebas, UV protection, antibakteri.

xxii ABSTRACT

Ylang-ylang or Cananga flower (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F. & Thoms.) is used to be Indonesia traditional cosmetic ingredients. This research aimed to isolate and identify active compounds in cananga flower extract that has a free radical scavenging activity 2,2-diphenyl-1-picrylhdrazyl (DPPH), UV protection, and antibacterial.

Cananga flowers extracted using ethanol 90% v/v, then evaporated to form the extract. Extracts of cananga flower separated in the thin layer chromatography (TLC) using optimum mobile phase chloroform : methanol (95: 5 v/v) and stationary phase silica gel 60 F254. The isolation of the active compound guided to DPPH radical scavenging activity test, UV protection with inhibition of bleaching of β-carotene method, and antibacterial with contact bioautografi method. Isolation of active compounds performed by column chromatography. Isolates tested qualitatively using DPPH free radical scavenging activity, UV protection with inhibition of bleaching of β-carotene method, and antibacterial with disc diffusion method. The active isolates was identified using various reagent.

By column chromatography showed 3 isolates. Isolate 1 has DPPH free radical scavenging activity and antibacterial activity. Isolate 2 and isolate 3 have DPPH free radical scavenging activity, UV protection activity, and antibacterial activity. The result showed that isolate 1, isolate 2 and isolate 3 were terpenoid compounds.

Keyword: Cananga flower (Cananga odorata), free radical scavengers, UV protection, antibacterial.

1 BAB I

PENGANTAR A. Latar Belakang

Indonesia merupakan negara yang memiliki kekayaan hutan tropis terbesar

kedua di dunia setelah Brazil. Indonesia memiliki lebih dari 30.000 spesies

tumbuhan tingkat tinggi dari 250.000 spesies yang ada di muka bumi ini.

Kekayaan alam Indonesia ini bisa dieksplorasi lebih lanjut karena setiap

tumbuhan merupakan sumber bahan kimia hayati (chemical resources) yang dapat diolah menghasilkan bahan kimia berguna (chemical prospective) melalui serangkaian proses lebih lanjut (Ersam, 2004). Metabolit sekunder yang

terkandung pada tumbuhan bersifat spesifik yang artinya tiap tumbuhan memiliki

kekhasan tersendiri. Selain itu metabolit sekunder yang terdapat pada tumbuhan

memiliki sifat bioaktif sehingga tidak akan pernah habis dan sangat menarik untuk

dieksplorasi. Metabolit sekunder dapat digunakan sebagai lead compounds dalam usaha penemuan dan pengembangan obat baru (Atun, 2010).

Menurut Tranggono (2007) perkembangan kosmetik akhir-akhir ini cukup

pesat, disebabkan karena kosmetik dianggap sudah menjadi salah satu kebutuhan

utama manusia untuk menjaga penampilan fisik. Kosmetik ada berbagai macam

jenis misalnya pelembab, pembersih, pelindung, dan untuk keperluan merias diri.

Alam Indonesia sejak berabad-abad yang lalu memberikan berbagai sumber

perawatan kesehatan termasuk kecantikan. Nenek moyang kita telah meramunya

ini menjadikan bukti bahwa nenek moyang kita sedari dulu telah mengolah bahan

alam tradisional untuk perawatan kecantikan (Tilaar, 1999). Sediaan kosmetik

diformulasikan untuk mengatasi penuaan dini pada kulit dan kelainan kulit,

seperti munculnya jerawat dan munculnya noda hitam (Tranggono, 2007). Oleh

karena itu, efektivitas kosmetik dapat dilihat dari kemampuannya terhadap

beberapa aspek, yaitu antioksidan, UV protection, dan antibakteri.

Antioksidan merupakan senyawa yang mampu menghambat aktivitas dari

radikal bebas. Antioksidan bekerja dengan cara menghambat reaksi oksidasi.

Apabila reaksi oksidasi ini tidak dihentikan maka akan mengakibatkan kerusakan

sel sehingga sel akan menjadi abnormal (Kim, Lee, Lee, dan Lee, 2002).

Indonesia merupakan negara yang memiliki iklim tropis sehingga

mendapatkan paparan sinar matahari yang tinggi sepanjang tahun. Spektrum sinar

matahari memancarkan energi pada rentang panjang gelombang tertentu.

Spektrum sinar matahari ini disebut gelombang ultraviolet (UV) yang dapat

berdampak buruk bagi kulit dan menjadi salah satu penyebab utama terjadinya

eritema dan pigmentasi pada kulit manusia (Lim dan Draelos, 2009). Paparan

jangka panjang dari radiasi sinar UV akan menyebabkan timbulnya efek penuaan

dini pada kulit dan kanker kulit. Salah satu cara untuk mengurangi paparan radiasi

sinar UV adalah dengan penggunaan tabir surya yang bersifat sebagai UV protector (Gadri, Darijono, Mauludin, dan Iwo, 2012).

Penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri semakin lama semakin

berkembang. Penyebab utama dari kasus tersebut adalah semakin tingginya

pemicu untuk terus melakukan kegiatan eksplorasi untuk menemukan obat-obatan

yang memiliki aktivitas antibakteri (Fitriyah, Jose, dan Saryono, 2013). Di bidang

perawatan kecantikan, senyawa yang memiliki kemampuan antibakteri sangat

menarik untuk dieksplorasi. Hal ini disebabkan karena bakteri merupakan salah

satu faktor yang dapat menyebabkan gangguan pada kulit, misalnya infeksi kulit

dan jerawat.

Berdasarkan uraian tersebut, penulis mempertimbangkan bahwa perlunya

dilakukan pembuktian ilmiah efektivitas penggunaan suatu bahan alam sebagai

salah satu bahan kosmetik tradisional. Penulis memilih bunga kenanga yang

digunakan sebagai salah satu bahan dalam kosmetik tradisional dengan bentuk

sediaan lulur. Penelitian terhadap bunga kenanga yang belum banyak dilakukan

menjadi pemicu tersendiri untuk terus melakukan eksplorasi.

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan permasalahan sebagai

berikut:

a. Apakah ekstrak bunga kenanga (C. odorata) mengandung senyawa yang memiliki aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection dan antibakteri?

b. Golongan senyawa apakah yang bertanggung jawab terhadap aktivitas

penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection dan antibakteri ?

2. Keaslian penelitian

Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang C. odorata pernah dilakukan oleh Indrakumar, Selvi, Gomathi, dan Karpagam (2012) yang bertujuan

untuk mengevaluasi kemampuan antibakteri ekstrak daun C. odorata secara in vitro. Beberapa kultur bakteri disiapkan untuk dilakukan pengujian dengan ekstrak daun dengan beberapa variasi pelarut, yaitu metanol, kloroform, dan

petroleum eter. Metode yang digunakan adalah well diffusion. Pengujian yang dilakukan mendapatkan kesimpulan bahwa ekstrak yang paling efektif adalah

ekstrak dengan pelarut metanol (Indrakumar dkk., 2012).

Penelitian lain tentang C. odorata pernah dilakukan oleh Brokl, Fauconnier, Benini, Lognay, Jardin, dan Focant (2013). Penelitian ini bertujuan

untuk melakukan karakterisasi kandungan kimia yang terdapat dalam minyak

atsiri C. odorata. Karakterisasi dilakukan dengan instrumentasi GCxGC-TOFMS dan menghasilkan kesimpulan bahwa terdapat 161 senyawa kimia termasuk 75

senyawa baru yang terdiri dari terpen, terpenoid ester, dan alkohol.

Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah

penelitian ini menggunakan sampel bunga C. odorata yang diambil dari Boyolali. Setelah itu, dilakukan pembuatan simplisia, pembuatan ekstrak etanolik dengan

etanol 90%, dilanjutkan dengan melakukan kromatografi lapis tipis (KLT)

terhadap ekstrak C. odorata dengan menggunakan fase gerak hasil optimasi. Hasil pemisahan kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak C. odorata di uji kualitatif untuk mengetahui aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri. Bercak yang potensial terhadap aktivitas tersebut diisolasi dengan

kromatografi kolom. Isolat yang dihasilkan diuji kualitatif penangkapan radikal

bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri. Selanjutnya, isolat diidentifikasi golongan senyawa menggunakan beberapa reagen.

3. Manfaat

a. Manfaat teoritis : penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

apakah bunga C. odorata memiliki aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri serta mengetahui golongan senyawa yang bertanggung jawab terhadap aktivitasnya.

b. Manfaat praktis : penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

apakah penggunaan bunga C. odorata sebagai bahan baku kosmetik tradisional sudah efektif.

B. Tujuan

1. Tujuan umum

Membuktikan kebenaran ilmiah penggunaan bunga kenanga sebagai

bahan baku kosmetik dilihat dari parameter aktivitas penangkapan radikal

bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri.

2. Tujuan khusus

a. Mengetahui apakah ada komponen senyawa dalam ekstrak C. odorata yang memiliki aktivitas penangkapan radikal bebas, UV protection, dan antibakteri.

b. Melakukan isolasi dan identifikasi golongan senyawa yang bertanggung

jawab terhadap aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri.

6 BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kenanga

1. Klasifikasi tanaman

Menurut United States Department of Agriculture (2014) klasifikasi tanaman kenanga adalah sebagai berikut.

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Superdivisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub Kelas : Magnoliidae

Ordo : Magnoliales

Famili : Annonaceae

Genus : Cananga

Sinonim : menurut Plant Resources of South-East Asia (2015) sinonim dari C. odorata yaitu Uvaria odorata Lamk (1785), Canangium odoratum (Lamk) Baillon (1868), Cananga scortechinii King (1922).

1. Deskripsi tanaman kenanga

Ciri-ciri tanaman kenanga adalah habitus pohon tahunan, batangnya besar

dengan diameter 0,1-0,7 m. Tinggi dapat mencapai 5-20 m. Daun bertangkai,

berbentuk bulat telur memanjang dengan ujung dan pangkal runcing, pangkal

membulat atau bentuk jantung, panjangnya 10-23 cm dan lebarnya 4,5-14 cm.

Ciri-ciri bunga kenanga adalah bunga majemuk dalam karangan bunga yang

berbentuk payung, pendek, menggantung, duduk di ketiak. Bunga mempunyai

enam lembar daun mahkota yang berbentuk lanset, pada waktu masih muda

berwarna hijau dan ketika sudah tua berubah menjadi warna kuning. Bunga

kenanga mempunyai bau harum dan khas, buah 7-15, perkembangannya tidak

sama, bulat telur terbalik dan berwarna hijau (Hembing, 2000).

2. Kandungan kimia kenanga

Minyak atsiri adalah komponen minyak esensial yang dapat diekstraksi

dari bunga C. odorata (Brokl et al, 2013). Minyak atsiri juga memiliki kemampuan sebagai agen antibakteri dan anti virus. Selain itu, minyak atsiri juga

memiliki kemampuan untuk melawan infeksi virus RNA dan DNA. Minyak atsiri

dapat berfungsi sebagai antioksidan yang dapat digunakan sebagai pengawet

makanan dan menangkal beberapa penyakit akibat pengaruh paparan radikal

Zat kimia yang terkandung pada bunga kenanga adalah minyak atsiri

(Hariana, 2008). Kandungan kimia utama minyak atsiri yang terdapat pada bunga

kenanga antara lain: geraniol, kresol, linalool, benzil alkohol, eugenol,

iso-eugenol, dan metil eugenol (Chooi, 2004). Sebagian besar monoterpen dan

seskuiterpen dalam minyak atsiri cukup aman, namun dapat menyebabkan iritasi

dan reaksi alergi pada beberapa orang yang sensitif. Lakton seskuiterpen

merupakan senyawa yang dapat menyebabkan reaksi alergi dan sitotoksik

(Heinrich, Barnes, Gibbons, dan Williamson, 2010).

B. Ekstraksi

Ekstraksi atau penyarian merupakan proses perpindahan massa atau zat

aktif yang berada di dalam sel kemudian ditarik masuk ke dalam larutan penyari.

Proses ekstraksi akan bertambah baik bila permukaan simplisia yang bersentuhan

dengan pelarut semakin besar (Harborne, 1987).

Syarat cairan penyari yang baik menurut Depkes RI (1986) adalah murah,

mudah diperoleh, stabil secara fisika dan kimia, tidak mudah menguap dan tidak

mudah terbakar, selektif, tidak berpengaruh terhadap zat berkhasiat, serta

diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku. Metode penyarian dibedakan menjadi:

infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambungan.

C. Antioksidan 1. Definisi antioksidan

Secara biologis, pengertian antioksidan adalah senyawa yang mampu

bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat

oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa dihambat (Winarsi,

2007). Secara umum, antioksidan dikelompokkan menjadi antioksidan enzimatis

dan non enzimatis. Antioksidan enzimatis contohnya superoksida dismutase,

katalase, dan glutation peroksidase. Antioksidan non enzimatis dibagi menjadi 2,

yaitu antioksidan larut lemak, dan antioksidan larut air. Antioksidan larut lemak

contohnya tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon, dan bilirubin. Antioksidan

larut air contohnya asam askorbat, asam urat, protein pengikat logam, dan protein

pengikat heme (Winarsi, 2007).

Radikal bebas diproduksi di dalam sel-sel tubuh dengan berbagai cara.

Adanya radiasi sinar ultraviolet, sinar X, sinar gamma radioaktif adalah

sumber-sumber yang mempengaruhi. Radiasi ini akan memecah ikatan di antara atom

sehingga terjadi berbagai radikal dengan elektron tunggal yang dapat

menimbulkan reaksi berantai yang menimbulkan kerusakan sel (Youngson, 1998).

2. Metode penangkapan radikal DPPH

Senyawa 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH) adalah suatu radikal yang memiliki kemampuan untuk direduksi oleh suatu antioksidan dan dapat diukur

dengan melihat penurunan nilai absorbansi pada panjang gelombang 517 nm

sehingga DPPH dapat digunakan untuk mengukur kapasitas penangkapan

senyawa radikal (Duh, 1999). Metode DPPH dipilih karena mampu mendeteksi

kemampuan antiradikal suatu senyawa karena hasilnya lebih akurat, reliabel,

Parameter aktivitas antioksidan dilihat dari nilai IC. IC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan penurunan 50% dari konsentrasi DPPH awal

(Sunarni, 2005).

Gambar 1. Reaksi DPPH dengan radical scavengers (Marston, 2011)

Senyawa yang beraksi sebagai penangkal radikal bebas akan mereduksi

DPPH dan mampu diamati dengan adanya perubahan warna DPPH dari ungu

menjadi kuning. Perubahan warna terjadi ketika elektron ganjil dari radikal DPPH

sudah berpasangan dengan hidrogen dari senyawa penangkal radikal bebas yang

akan membentuk DPPH-H tereduksi (Molyneux, 2004).

D. UV Protection 1. Definisi UV protection

Penggunaan tabir surya dianjurkan di negara tropis untuk melindungi kulit

dari radiasi ultraviolet. Tabir surya berfungsi untuk mengurangi efek radiasi

ultraviolet yang dapat menimbulkan kerusakan pada kulit seperti penuaan dini,

2. Metode inhibition of bleaching of �-carotene

Metode β-karoten adalah metode yang digunakan untuk memperkirakan kemampuan relatif dari ekstrak terhadap oksidasi dari asam linoleat yang akan

mengoksidasi β-karoten dalam emulsi. Akibat dari adanya oksidasi oleh asam

linoleat ini maka β-karoten akan kehilangan warna karena putusnya ikatan rangkap sehingga terjadi perubahan warna (Miguel, 2010).

Analisis bleaching β-karoten dilakukan secara kualitatif dengan cara menyemprotkan larutan β-karoten ke pelat KLT hasil elusi dari sampel yang diuji. Kemudian pelat KLT dipanaskan di bawah sinar matahari dan dihitung waktu

yang diperlukan dari saat dipanaskan hingga warna oranye β-karoten hilang. Senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan dan UV protection adalah senyawa yang mampu mempertahankan warna β-karoten lebih lama (Rochmaulana dan Wahyudi, 2009).

Gambar 2. Struktur senyawa β-karoten

E. Antibakteri 1. Definisi antibakteri

Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) adalah suatu konsentrasi paling

rendah suatu zat yang mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme

(Sacher, 2004). Kadar bunuh minimum (KBM) adalah kadar paling rendah suatu

zat yang diperlukan untuk membunuh mikroba (Nugroho, 2012).

2. Metode bioautografi

Metode bioautografi dapat digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri

dan antikapang sekaligus mendeteksi golongan senyawa. Bioautografi dibedakan

menjadi bioautografi kontak, bioautografi agar overlay, dan bioautografi langsung. Bioautografi kontak dilakukan dengan menempelkan kromatogram

pada media padat berisi bakteri uji. Senyawa dengan aktivitas antibakteri

ditunjukkan dengan daerah jernih. Bioautografi agar overlay dilakukan dengan cara melapisi kromatogram dengan agar cair yang berisi bakteri uji dan setelah

mengeras diberi pewarnaan. Adanya senyawa antibakteri ditunjukkan dengan

adanya pita-pita yang terbentuk. Bioautografi langsung dilakukan dengan cara

menyemprot kromatogram dengan bakteri uji dan dilakukan inkubasi. Adanya

senyawa antibakteri ditunjukkan dengan bantuan pewarnaan menggunakan

Keuntungan metode bioautografi dibandingkan metode yang lain adalah

dapat digunakan untuk mengetahui secara langsung aktivitas biologi dari hasil

pemisahan senyawa yang kompleks, cepat, mudah, dan murah untuk dilakukan.

Selain itu interpretasi hasilnya juga mudah dan akurat (Kusumaningtyas, 2008).

3. Metode difusi

Salah satu metode difusi yang biasa dilakukan untuk menentukan aktivitas

antimikroba adalah dengan menggunakan cakram (disc). Zat yang akan diuji ditampung dalam cakram kertas yang ditempelkan pada media agar yang telah

diinokulasikan bakteri uji. Selanjutnya dilakukan inkubasi pada waktu dan suhu

tertentu sesuai persyaratan dan kondisi optimum mikroba uji. Hasil positif

ditandai dengan adanya zona penghambatan berupa daerah bening di sekitar

cakram kertas (Pelczar dan Chan, 1988).

Prinsip penentuan aktivitas antimikroba dengan metode difusi adalah

kemampuan difusi dari zat uji pada media agar yang telah diinokulasikan bakteri

tertentu. Hasil positif ditandai dengan adanya zona hambatan di sekeliling zat

yang diuji setelah dilakukan inkubasi selama waktu tertentu (Brooks, Butel,

Carrol, dan Morse, 2007).

F. Kromatografi 1. Kromatografi lapis tipis (KLT)

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) adalah suatu bentuk kromatografi planar.

Pada KLT fase diam yang ada berupa lapisan yang seragam pada permukaan

plastik. Fase gerak akan bergerak sepanjang fase diam diam karena pengaruh

kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Gandjar dan Rohman, 2007).

Pemisahan pada KLT akan optimal apabila penotolan sampel dilakukan

dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin sehingga menghasilkan

resolusi yang baik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penotolan secara

otomatis lebih dipilih daripada penotolan manual bila jumlah sampel lebih dari 15

μl. Penotolan sampel yang tidak tepat akan menyebabkan bercak menyebar dan

puncak ganda (Gandjar dan Rohman, 2007).

Bercak hasil pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang

tidak berwarna. Oleh karena itu, beberapa cara yang dapat dilakukan untuk

mendeteksi bercak antara lain:

1. Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan

bereaksi secara kimia dengan solut yang mempunyai gugus fungsi tertentu

sehingga bercak menjadi berwarna khas.

2. Mengamati lempeng di bawah sinar ultraviolet pada panjang gelombang

254 atau 366 untuk menampakkan solut sebagai bercak yang gelap atau bercak

yang berfluorosensi terang pada dasar yang berfluoresensi seragam.

3. Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrit pekat lalu

dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik sehingga akan tampak bercak

4. Melakukan scanning lempeng hasil pemisahan menggunakan instrumen densitometer. Solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat sebagai peak oleh recorder (Gandjar dan Rohman, 2007).

2. Kromatografi kolom

Kromatografi kolom merupakan metode pemisahan dengan menggunakan

kolom gelas diisi dengan adsorbent yang dilewatkan oleh desorbent berupa larutan campuran. Masing-masing komponen akan dipisahkan dalam kolom yang

diatur dengan afinitas adsorpsi setiap komponen (Lazo, 1999).

Solven murni dapat digunakan untuk mengelusi semua komponen. Selain

itu, sistem gradien pelarut juga digunakan. Pada elusi gradien, polaritas sistem

solven ditingkatkan secara perlahan dengan meningkatkan konsentrasi solven ke

tingkat yang lebih polar. Pemilihan eluen tergantung pada jenis adsorben yang

digunakan dan kemurnian senyawa yang dipisahkan. Pelarut harus mempunyai

kemurnian yang tinggi. Keberadaan pengganggu seperti air, alkohol, atau asam

pada solven yang kurang polar mampu mengganggu aktivitas adsorben

(Braithwaite dan Smith, 1995).

G. Keterangan Empiris

Bunga kenanga telah digunakan sebagai bahan baku kosmetik tradisional.

Dari penelitian ini ingin diketahui komponen senyawa dalam bunga kenanga yang

memiliki aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, UV protection, dan antibakteri serta mengetahui golongan senyawa yang bertangung jawab terhadap aktivitas

16 BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksploratif.

B. Bahan dan Materi Penelitian 1. Bahan penelitian

a. Bahan utama berupa bunga kenanga yang berasal dari Boyolali, Jawa

Tengah.

b. Bahan kimia yang digunakan meliputi DPPH pro analitik dan �-karoten pro analitik yang berasal dari Sigma Chem. Co., USA. n-heksana, etanol,

metanol, kloroform, NaCl, barium klorida, dan asam sulfat pro analitik yang

berasal dari Merck, Jerman. Akuades berasal dari Brataco Chemica. Reagen

Dragendorff, alumunium chloride, ferric chloride, sitroborat, iod, vanilin sulfat berasal dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Universitas Sanata

Dharma. Silika gel 60 F254 for thin layer chromatography dan silika gel 60 (0,040-0,063 mm) for column chromatography dari Merck, Jerman. Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923dan Escherichia coli ATCC 25922 yang berasal dari Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta. Amoksisilin berasal

dari PT. Indofarma. Trypticasein soy broth (TSB) berasal dari Agarindo Biological Company, dan agar No.1 diperoleh dari Oxoid.

2. Alat penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa micro haematocrit tubes, light meter (Lutron) LX-1118 Digital Instruments, lampu UV 254 nm, lampu UV 366 nm,vortex (Buchi), mikropipet 1-10 mL (Acura Socorex), mikropipet 10-1000 μL (Acura Socorex), timbangan analitik (Scaltec SBC 22 dan BP 160P), vacuum rotary evaporator (Buchi), blender, kertas saring, tabung reaksi bertutup dan alat-alat gelas yang biasa digunakan di laboratorium analisis

(Pyrex-Germany dan Iwaki), autoclave (YX-400Z), freezer, dan oven (WTB binder).

C. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi sampel

Determinasi bunga kenanga dilakukan di Bagian Biologi Farmasi,

Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Determinasi tersebut

memastikan bahwa sampel yang digunakan untuk penelitian benar-benar bunga

kenanga (Cananga odorata (Lmk.) Hook. F. & Thoms.).

2. Pengumpulan dan penyiapan bahan a. Pengumpulan bahan

Bahan utama berupa bunga kenanga yang berasal dari Boyolali, Jawa

Tengah. Bunga kenanga berumur 2 minggu dipanen dini hari pada bulan Juli

b. Sortasi basah

Bahan baku dipisahkan dari bahan-bahan pengotor yang mungkin

terdapat pada simplisia seperti kerikil, tanah, rumput, serta bagian tanaman

yang tidak dibutuhkan (batang dan daun), bagian tanaman lain, bahan yang

rusak dan lain-lain.

c. Pencucian

Bunga kenanga dicuci menggunakan air mengalir lalu dibersihkan

kotoran-kotoran yang melekat. Tahap pencucian ini dilakukan sebanyak tiga

kali untuk menjamin kebersihan bahan.

d. Pengeringan

Bunga kenanga yang masih basah diletakkan pada tampah bambu dengan

ketebalan seminimal mungkin. Tampah bambu ditutup dengan kain hitam

yang diberi sedikit sirkulasi udara lalu dijemur dibawah sinar matahari. Akhir

pengeringan ditandai dengan warna bahan menjadi lebih gelap dan mudah

dipatahkan.

e. Sortasi kering

Bunga kenanga yang sudah kering dipisahkan dari bahan-bahan lain

seperti tanah, kerikil, ranting, daun, bahan yang rusak dan lain-lain.

f. Pengepakan dan penyimpanan

Simplisia bunga kenanga kemudian dibungkus dengan menggunakan

amplop kertas kedap udara yang diberi silika gel. Penyimpanan dilakukan

g. Susut pengeringan simplisia bunga kenanga

Bobot tetap dilakukan terhadap cawan petri yang akan digunakan selama

60 menit menggunakan oven pada suhu 105°C. Setelah didapatkan bobot tetap

petri, serbuk simplisia bunga kenanga ditimbang 1 g dan dilakukan replikasi 3

kali. Cawan berisi serbuk simplisia dipanaskan dalam oven bersuhu 105°C

hingga bobot tetap.

3. Ekstraksi

a. Ekstraksi bunga kenanga

Simplisia bunga kenanga ditimbang sebanyak 1,0 kg dan diblender

dengan etanol 90% sampai seluruh bahan tercampur homogen. Campuran

dimaserasi pada suhu ruangan selama satu hari. Dilakukan remaserasi dengan

cara yang sama dengan tahap maserasi. Filtrat diperoleh melalui penyaringan

dan penguapan pelarut dengan vacuum rotary evaporator sehingga dihasilkan ekstrak.

b. Susut pengeringan ekstrak bunga kenanga

Tiga cawan petri disiapkan, ditimbang dan dipanaskan hingga mencapai

bobot tetap pada oven dengan suhu 105°C. Silika yang telah dihaluskan

disiapkan, lalu dipanaskan dahulu dalam oven bersuhu 105°C selama 60

menit. Bila cawan petri sudah mencapai bobot tetap, ekstrak ditimbang ± 0,5 g

(replikasi 3 kali) dan masing-masing cawan yang berisi ekstrak tersebut

ditambahkan ± 0,5 g silika. Cawan petri tersebut kemudian dimasukkan dalam

Saat kadar air ekstrak yang diuji lebih dari 10%, maka pada ekstrak perlu

dilakukan penguapan air dengan cara dimasukkan dalam desikator berisi batu

gamping.

c. Pemerian ekstrak bunga kenanga

Ekstrak bunga kenanga diamati warna, bau, bentuk dan rasa.

4. Kromatografi lapis tipis ekstrak a. Preparasi sampel

Sebanyak 5 mg ekstrak bunga kenanga ditimbang lalu dilarutkan dalam

etanol p.a 1 mL.

b. Optimasi fase gerak

Sampel ekstrak bunga kenanga ditotolkan sebanyak 3 spot pada pelat

KLT dengan jarak elusi 5 cm (Wolf, 2012). Sampel ditotolkan menggunakan

pipa kapiler. Pelat KLT kemudian dielusi dengan 3 jenis fase gerak berikut :

1) Fase gerak nonpolar = n-heksana: etil asetat (2:3 v/v)

2) Fase gerak semipolar = kloroform:metanol (7:3 v/v)

3) Fase gerak polar = etil asetat : asam formiat : asam asetat

glasial : air (100:11:11:20 v/v) (Wagner

dan Bladt, 1996).

c. Deteksi pemisahan KLT

Pelat KLT hasil elusi dikeringkan beberapa saat pada suhu ruang,

kemudian pelat KLT tersebut dideteksi menggunakan lampu UV 254 nm dan

366 nm. Hasil elusi dari ketiga fase gerak tersebut kemudian dibandingkan

5. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas DPPH a. Preparasi pereaksi semprot DPPH

Pereaksi DPPH dibuat dengan konsentrasi 0,2% b/v dalam pelarut

metanol, lalu dimasukkan dalam wadah gelap dan tertutup (Marston, 2011).

b. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal dengan pereaksi DPPH

Pelat KLT hasil elusi yang telah kering disiapkan untuk disemprot

dengan pereaksi DPPH, hasil positif ditandai dengan adanya bercak kuning

dengan latar ungu pada pelat KLT.

6. Uji kualitatif aktivitas UV protection a. Preparasi pereaksi �-karoten

Pereaksi �-karoten dibuat dengan konsentrasi 0,05% b/v dalam pelarut kloroform, lalu dimasukkan dalam wadah gelap dan tertutup (Marston, 2011).

b. Optimasi intensitas sinar UV

Pelat KLT kosong disiapkan, kemudian pelat tersebut dicelupkan dalam

pereaksi �-karoten. Warna diukur dengan parameter warna lalu dicatat. Pelat tersebut kemudian disinari dengan menggunakan lampu UV. Perubahan warna

yang terjadi diamati lalu diukur dengan parameter warna pada menit ke 1, 3, 6,

9, dan 15. Posisi dari lampu UV diatur dalam posisi tinggi (100 cm), sedang

(50 cm), rendah (35 cm) dan dihitung intensitas sinar dengan alat light meter. Tiap posisi lampu dilakukan uji dengan replikasi 5 kali. Perubahan warna

yang terjadi dicatat lalu dihitung rata-rata dan SD.

c. Uji kualitatif UV protection (�-karoten bleaching test)

Pelat KLT hasil elusi yang telah dikeringkan beberapa saat dicelupkan

dalam pereaksi �-karoten. Sebelum warna pelat KLT tersebut diukur dengan menggunakan parameter warna lalu dicatat. Pelat KLT tersebut kemudian

disinari sinar UV dengan jarak sesuai hasil optimasi dan dihitung intensitas

sinar dengan alat light meter. Perubahan warna yang terjadi diamati lalu diukur dengan parameter warna pada menit ke 1, 3, 6, 9, dan 15. Replikasi 5

kali dilakukan dan perubahan warna yang terjadi dicatat lalu dihitung rata-rata

dan SD.

7. Uji kualitatif aktivitas antibakteri a. Pembuatan media TSB cair

Sebanyak 3 g media TSB (30g/L) dilarutkan dalam 100 mL akuades, diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen, kemudian media tersebut

diautoklaf.

b. Pembuatan media agar

Sebanyak 3 g media TSB (30g/L) ditambahkan 1,2% b/v agar dilarutkan

dalam 100 mL akuades. Diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen,

kemudian media tersebut diautoklaf.

c. Pembuatan larutan McFarland 0,5 (1,6 x 108 CFU)

Larutan barium klorida 1,175% (b/v) 0,05 mL ditambah 9,95 mL larutan

1% (b/v) asam sulfat (Schwalbe, Moore, dan Goodwin, 2007).

d. Pembuatan NaCl 0,9% (b/v)

e. Preparasi bakteri uji

Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli dan S.aureus. Kultur bakteri induk dari media miring diambil sebanyak 1 ose lalu dikulturkan pada media

TSB cair. Kultur bakteri diinkubasi selama 18 jam.

f. Pembuatan larutan induk bakteri

Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli dan S.aureus. Sebanyak 2 tabung reaksi disiapkan, masing-masing diisi dengan saline water 10 mL dan setarakan kekeruhannya menggunakan larutan standar Mc Farland 0,5

(konsentrasi mikroba 1,6. 108 CFU/ml) dengan penambahan bakteri ke dalam tabung reaksi.

g. Penyimpanan kultur bakteri

Sisa kultur bakteri yang belum digunakan untuk diuji, diambil 0,5 mL

lalu dimasukkan ke dalam microtube. Gliserol sebanyak 5% v/v dari 0,5 mL kultur bakteri ditambahkan, yaitu 25. 10-3mL pada masing-masing microtube. Campuran dihomogenkan lalu diinkubasi selama 1 jam dalam inkubator

bersuhu 37°C. Setelah itu kultur bakteri disimpan dalam freezer. h. Pembuatan kontrol kontaminasi media

Media agar sebanyak 15 mL diambil, dituang ke dalam petri steril secara

pour plate lalu dibiarkan memadat. Media diinkubasi selama 18 jam.

i. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji

Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan

spreading dengan menggunakan cotton buds steril. Inkubasi dilakukan selama 18 jam.

j. Pembuatan kontrol positif

Media agar sebanyak 15 mL TSB lalu dibiarkan memadat. 100 mikroliter

bakteri diinokulasikan secara spreading menggunakan cotton buds steril. Amoksisilin 5 mg ditimbang dan dilarutkan dalam 1 mL akuades. Sebanyak

75; 100;150 µg amoksisilin diambil lalu diteteskan pada paper disc dalam media agar yang telah diinokulasikan bakteri. Inkubasi dilakukan selama 18

jam.

k. KLT ekstrak bunga kenanga

Ekstrak bunga kenanga dengan konsentrasi 5 mg/mL dalam etanol

disiapkan untuk ditotolkan pada pelat KLT sebanyak 75; 100; 150 µg dengan

menggunakan mikropipet. Pelat KLT dielusi dengan fase gerak kloroform :

metanol (95 : 5 v/v). Pelat KLT kemudian dikeringkan pada suhu ruang secara

aseptis (dibuat 2 kali replikasi: sebagai acuan dan sebagai pelat uji

bioautografi).

l. Bioautografi

Pelat KLT hasil elusi yang telah dikeringkan secara aseptis ditempelkan

pada media agar yang telah diinokulasikan bakteri 100 µL secara spreading. Kontak dilakukan selama 40 menit, kemudian pelat KLT tersebut diangkat

secara aseptis. Inkubasi dilakukan selama 18 jam dan dibandingkan kontrol

negatif dan pelat KLT acuan. Hasil positif ditandai dengan adanya zona

8. Identifikasi golongan senyawa ekstrak

Pelat KLT hasil elusi disiapkan untuk diidentifikasi menggunakan reagen

semprot. Reagen semprot yang digunakan yaitu Dragendorff, alumunium chloride, ferric chloride, sitroborat, iodium, dan vanilin sulfat, kemudian diamati perubahan warna dan dihitung nilai Rf dari bercak.

9. Pembersihan klorofil dengan karbon aktif

Sebanyak 28 g ekstrak bunga kenanga diambil dan ditampung dalam gelas

beaker. Sebanyak 1,6 g karbon aktif ditumbuk halus dan dipanaskan dalam

oven dengan suhu 1050 C selama 30 menit. Ekstrak bunga kenanga dilarutkan dengan pelarut kloroform : metanol (1 : 1 v/v) sambil diaduk dengan batang

pengaduk. Taburkan karbon aktif yang sudah diaktivasi lalu diaduk dengan

batang pengaduk. Campuran disaring lalu filtrat dipekatkan menggunakan

tangas air.

10. Kromatografi kolom

a. Preparasi sampel untuk uji kromatografi lapis tipis

Ekstrak hasil pembersihan klorofil ditimbang 2,5 mg dilarutkan dalam

0,5 mL metanol.

b. Uji kromatografi lapis tipis (KLT) untuk optimasi fase gerak kolom

Hasil preparasi sampel ditotolkan pada pelat KLT. Disiapkan 4 fase

gerak yaitu: n-heksana : kloroform (50:50 v/v), n-heksana : kloroform (25:75

v/v), kloroform , dan kloroform : metanol (98:2 v/v). Pelat KLT dielusi

c. Preparasi sampel untuk kromatografi kolom

Ekstrak hasil sebanyak 300 mg pembersihan klorofil ditimbang dan

dicampurkan dengan silika gel 60 untuk kolom kromatografi dengan

perbandingan 1:1.

d. Preparasi kolom kromatografi

Kolom kromatografi disiapkan dengan urutan dari bawah yaitu kapas

yang telah dibilas n-heksana, silika gel 60 untuk kolom kromatografi dengan

tinggi 3 cm, sampel yang telah dicampur dengan silika gel 60 untuk kolom

kromatografi 0,5 cm, silika gel 60 untuk kolom kromatografi 1 cm, dan

ditutup dengan kapas yang telah dicuci dengan n-heksana.

e. Kromatografi kolom

Kolom kromatografi yang telah disiapkan, dialiri fase gerak dengan

urutan sebagai berikut: n-heksana: kloroform (70 : 30 v/v), (60 : 40 v/v),

(50:50 v/v), (40:60 v/v), kloroform, kloroform : metanol (90:10 v/v). Masing – masing fase gerak disiapkan 5 mL. Tiap 2 mL hasil elusi kolom kromatografi

ditampung pada tabung yang telah diberi tanda.

f. Konfirmasi hasil kromatografi kolom dengan kromatografi lapis tipis

(KLT)

Setiap tabung hasil kolom kromatografi yang dikumpulkan dilakukan

KLT. Profil KLT hasil kolom kromatografi yang sama disatukan kemudian

g. Penyimpanan isolat

Isolat hasil pemekatan dilarutkan pada pelarut sesuai dan dipindahkan

pada microtube dengan konsentrasi 1 mg/100 µL kemudian dipekatkan dan disimpan dalam freezer.

11. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH isolat a. Preparasi sampel

Isolat disiapkan dengan konsentrasi 1mg/mL dengan menggunakan

pelarut yang sesuai.

b. Kromatografi lapis tipis (KLT) isolat

Isolat di totolkan pada pelat kromatografi lapis tipis (KLT) dengan mass loading sebesar 10, 20, dan 30 µg, dibandingkan dengan ekstrak bunga kenanga yang ditotolkan dengan mass loading sebesar 10 µg, dielusi dengan jarak elusi 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan

dikeringkan pada suhu ruang.

c. Uji kualitatif penangkapan radikal DPPH

Pelat KLT hasil elusi yang telah kering disiapkan. Pelat KLT disemprot

menggunakan pereaksi DPPH 0,2% b/v dalam metanol. Hasil positif ditandai

dengan timbulnya bercak kuning dengan latar ungu pada pelat KLT.

Perubahan warna pada pelat KLT dari ungu menjadi kuning diamati, diukur,

12. Uji kualitatif aktivitas UV protection isolat a. Preparasi sampel

Isolat disiapkan dengan konsentrasi 1 mg/mL dengan menggunakan

pelarut yang sesuai.

b. Kromatografi lapis tipis (KLT) isolat

Isolat ditotolkan pada pelat kromatografi lapis tipis (KLT) dengan mass loading sebesar 10, 20, dan 30 µg, dielusi dengan jarak 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan dikeringkan pada suhu ruang.

c. Uji kualitatif UV protection

Pelat KLT hasil elusi yang telah dikeringkan dicelupkan dalam pereaksi

�-karoten 0,05% b/v dalam kloroform. Sebelum disinari dengan UV, warna pelat KLT diukur menggunakan parameter warna. Pelat KLT kemudian

disinari dengan sinar UV dengan jarak sesuai hasil optimasi yaitu pada

ketinggian 50 cm dan dihitung intensitas sinar dengan alat light meter. Perubahan warna yang terjadi diamati pada menit ke 1, 3, 6, 9, 12, dan 15.

13. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat a. Preparasi sampel

Isolat disiapkan dengan konsentrasi 1 mg/mL menggunakan pelarut yang

sesuai.

b. Pembuatan media agar

Sebanyak 3 g media TSB (30g/L) ditambahkan 1,2% b/v agar lalu

dilarutkan dalam 100 mL akuades. Campuran diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen kemudian media tersebut diautoklaf.

c. Pembuatan NaCl 0,9% b/v

Sebanyak 0,9 g NaCl ditimbang dan dilarutan dalam 100 mL akuades.

d. Pembuatan larutan induk bakteri

Bakteri uji yang digunakan adalah S.aureus. Tabung reaksi yang diisi dengan saline water 10 mL disiapkan dan setarakan kekeruhannya menggunakan larutan standar Mc Farland 0,5 (konsentrasi mikroba 1,6. 108 CFU/ml) dengan penambahan bakteri ke dalam tabung reaksi.

e. Pembuatan kontrol kontaminasi media

Media agar sebanyak 15 mL diambil, dituang ke dalam cawan petri steril

secara pour plate lalu dibiarkan memadat. Inkubasi dilakukan selama 18 jam.

f. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji

Media agar TSB sebanyak 15 mL dalam tabung diambil, dibiarkan

memadat pada cawan petri steril.100 µL bakteri diinokulasikan secara

spreading dengan menggunakan cotton buds steril. Inkubasi dilakukan selama 18 jam.

g. Pembuatan kontrol positif

Media agar sebanyak 15 mL diambil, TSB dalam tabung, dibiarkan

memadat pada cawan petri steril. 100 mikroliter bakteri diinokulasikan secara

spreading menggunakan cotton buds steril. Amoksisilin 5 mg ditimbang dan dilarutkan dalam 5 mL akuades. Sebanyak 75, 100, dan 150 µg diambil lalu

masing-masing ditotolkan pada paper disc dalam media agar yang telah diinokulasikan bakteri. Inkubasi dilakukan selama 18 jam.

Isolat dengan konsentrasi 1 mg/mL disiapkan dengan pelarut yang sesuai.

Paper disc diletakkan dalam cawan petri steril dan diisikan isolat senyawa dengan massa isolat sebesar 50, 100, dan 200 µg secara aseptis. Paper disc dibiarkan kering dari sisa pelarut isolat. Paper disc diletakkan pada media yang telah diinokulasikan bakteri S. aureus secara aseptis. Inkubasi selama 18 jam dilakukan. Hasil positif ditandai dengan adanya zona hambat pada media

tersebut.

14. Identifikasi golongan senyawa isolat a. Kromatografi lapis tipis (KLT) isolat

Isolat disiapkan dengan konsentrasi1 mg/mL. Tiap isolat ditotolkan 10 µ L

pada pelat KLT. Dielusi dengan jarak elusi 5 cm menggunakan fase gerak

kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan dikeringkan pada suhu ruang.

b. Identifikasi senyawa dengan reagen semprot

Pelat KLT hasil elusi disiapkan untuk diidentifikasi senyawa dengan

menggunakan beberapa reagen yaitu reagen Dragendorff, alumunium chloride, ferric chloride, dan vanilin sulfat. Perubahan warna diamati dan dihitung nilai Rf dari bercak yang terbentuk.

15. Bagan alur penelitian

Bunga kenanga

Simplisia bunga kenanga

Ekstrak bunga kenanga

Ekstrak bebas klorofil Uji kualitatif aktivitas

penangkapan radikal bebas DPPH, UV protection dan

antibakteri

Isolat Diketahui bercak KLT ekstrak

bunga kenanga yang aktif

Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas

DPPH, UV protection dan antibakteri Proses pembuatan simplisia Ekstraksi : - Maserasi - Penyaringan - Pemekatan Kromatografi kolom step gradien Penghilangan klorofil Golongan senyawa Identifikasi Isolat aktif Identifikasi Golongan senyawa

32 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Sampel

Determinasi sampel dilakukan di Bagian Biologi Farmasi Fakultas

Farmasi Universitas Gadjah Mada. Tujuan dilakukan determinasi sampel adalah

untuk memastikan kebenaran identitas sampel yang digunakan sehingga

menghindari kesalahan analisis dalam fitokimia. Hasil determinasi menunjukkan

bahwa tanaman yang digunakan adalah (Cananga odorata (Lmk.) Hook.F.& Thoms.) dan dikenal dengan nama lokal bunga kenanga.

B. Pengumpulan dan Penyiapan Bahan

Bunga kenanga yang digunakan sebagai sampel penelitian berasal dari

Boyolali, Jawa Tengah. Bunga kenanga dipanen pada bulan Juli waktu dini hari

dari pohon kenanga berumur 7 tahun dengan umur bunga 2 minggu. Pengambilan

sampel berasal dari daerah yang sama untuk menghindari variasi kandungan kimia

tanaman yang disebabkan aspek lingkungan (edafik, tempat tumbuh, geografis,

cuaca, dan iklim).

Bunga kenanga yang dijadikan sebagai sampel penelitian memiliki

karakteristik berwarna hijau semburat kuning yang menandakan bahwa bunga

kenanga tidak terlalu muda dan tidak terlalu tua. Bila sampel yang digunakan

sudah banyak berkurang, sedangkan bila sampel terlalu muda maka dikhawatirkan

metabolit sekunder yang terkandung pada sampel masih belum sempurna.

Sampel bunga kenanga dipanen pada bulan Juli agar kandungan kimia

pada sampel tetap maksimal sebab pemanenan yang ideal dilakukan pada musim

kemarau. Secara umum, metabolit sekunder pada tanaman yang dipanen pada

musim kemarau akan terkandung lebih banyak daripada saat musim hujan.

Pemanenan bunga kenanga dilakukan pada dini hari untuk menghindari

berkurangnya metabolit sekunder, sebab pada siang hari metabolit sekunder dapat

berkurang karena mengalami proses penguapan atau kerusakan senyawa karena

paparan radiasi UV.

Selanjutnya sampel bunga kenanga dibuat dalam bentuk simplisia. Setelah

pemanenan, dilakukan sortasi basah pada bunga kenanga. Sortasi basah dilakukan

dengan cara memisahkan sampel yang hendak diambil dengan bahan-bahan lain

yang kemungkinan terdapat pada sampel, misalnya batang, daun, kerikil, serta

bagian tanaman dan bahan lain yang tidak diinginkan. Kemudian bunga kenanga

dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan berbagai kotoran yang melekat

pada sampel. Setelah bersih, bunga kenanga diletakkan pada tampah yang terbuat

dari anyaman bambu dengan ketebalan seminimal mungkin. Bunga kenanga lalu

dikeringkan dibawah sinar matahari. Tampah bambu diberi penutup kain hitam

dengan sedikit sirkulasi udara dengan tujuan untuk meratakan pemanasan serta

menghindari kerusakan senyawa kimia akibat paparan langsung dengan sinar

matahari. Pengeringan dihentikan saat bunga kenanga sudah kering yang dicirikan

kering untuk memisahkan bunga kenanga dari pengotor yang kemungkinan

melekat saat proses pengeringan atau pengotor yang belum dbersihkan pada

proses-proses sebelumnya. Simplisia yang dihasilkan disimpan pada amplop

kertas yang diberi penambahan silika pengering dengan tujuan menghindari

adanya lembab.

C. Ekstraksi 1. Ekstraksi bunga kenanga

Prinsip ekstraksi adalah proses pengambilan senyawa-senyawa kimia yang

semula berada dalam sel, ditarik oleh larutan penyari sehingga senyawa-senyawa

kimia berada dalam larutan penyari. Proses ekstraksi pada penelitian ini dilakukan

dengan 2 tahap, yaitu simplisia diblender dengan larutan etanol 90% v/v lalu

dilanjutkan dengan proses maserasi. Proses pemblenderan simplisia dilakukan

untuk menyari langsung komponen minyak atsiri yang kemungkinan akan

menguap apabila dilakukan penyerbukan simplisia. Selanjutnya dilakukan dengan

maserasi untuk memaksimalkan penyarian. Pada proses maserasi, cairan penyari

akan menembus dinding sel lalu masuk menembus rongga sel yang berisi

senyawa kimia. Senyawa kimia tersebut akan larut dalam cairan penyari lalu

berdifusi keluar sel hingga terjadi kesetimbangan senyawa di dalam dan luar sel.

Adanya shaker pada proses maserasi bertujuan untuk meningkatkan energi mekanik sehingga seluruh serbuk hasil blender dapat terbasahi sehingga

membantu proses difusi komponen senyawa.

Maserasi dipilih karena selain mudah dilakukan, metode ini tidak

dihindari. Hal ini sangat mendukung proses isolasi karena proses ekstraksi

komponen kimia tumbuhan dapat berjalan optimal. Larutan penyari yang

digunakan adalah etanol 90% v/v. Tujuan digunakan penyari etanol 90% v/v

karena komposisi ini merupakan pelarut yang bersifat universal sehingga relatif

dapat menyari komponen kimia yang cenderung lebih nonpolar maupun polar.

Setelah proses maserasi selesai, hasil maserasi disaring menggunakan kain

mori yang terlebih dulu dicuci dengan air mendidih yang bertujuan untuk

menghilangkan komponen lilin yang melekat pada kain. Setelah itu filtrat disaring

kembali dengan kertas saring Whatman nomor 41 sebelum kemudian dipekatkan

dengan vacuum rotary evaporator. Dengan alat ini, etanol yang digunakan sebagai pelarut dapat diuapkan dan dikondensasikan kembali sehingga etanol

dapat diperoleh kembali dan sudah terpisah dari ekstrak. Adanya pompa vakum

akan membuat tekanan pada sistem akan turun sehingga akan terjadi penguapan

pelarut dibawah titik didih normal. Labu yang berputar pada proses ini berfungsi

untuk meratakan pemanasan sehingga proses penguapan pelarut dapat berjalan

dengan baik. Hasil dari pemekatan dengan vacuum rotary evaporator adalah ekstrak bebas penyari.

2. Susut pengeringan simplisia dan ekstrak bunga kenanga (C. odorata) Prinsip susut pengeringan adalah pengukuran sisa bahan setelah dilakukan

pemanasan pada suhu 105°C hingga dicapai bobot tetap yang kemudian

dinyatakan dalam persen. Tujuan dilakukan susut pengeringan adalah untuk

pemanasan. Keuntungan menggunakan metode susut pengeringan adalah cepat,

mudah, murah, dan hanya membutuhkan jumlah sampel yang sedikit.

Persentase yang diperoleh pada susut pengeringan simplisia dan ekstrak

berturut-turut adalah 15,40 % b/b dan 24,61 % b/b. Berdasarkan monografi resmi

terbitan Departemen Kesehatan RI, persyaratan kadar air pada simplisia yang akan

digunakan sebagai bahan baku obat adalah tidak lebih dari 10% b/b. Karena

penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi senyawa maka persentase susut

pengeringan diatas dapat diterima. Selain itu metode susut pengeringan

merupakan metode yang tidak spesifik untuk pengukuran kadar air dan hanya

memberikan batasan maksimal untuk total senyawa yang menguap selama

pemanasan. Sampel bunga kenanga memiliki banyak kandungan senyawa yang

mudah menguap seperti minyak atsiri, sehingga bila diukur penetapan kadar air

dengan metode yang lebih spesifik akan memberikan persentase hasil yang lebih

rendah. Hal ini menyimpulkan bahwa proses pembuatan simplisia sudah cukup

baik.

Persentase susut pengeringan ekstrak yang didapatkan masih terlalu tinggi

sehingga menggambarkan masih banyak kandungan air pada ekstrak. Apabila

kandungan air pada ekstrak terlalu tinggi maka ada kemungkinan terjadi reaksi

enzimatik yang membuat rusaknya senyawa kimia pada ekstrak. Rusaknya

senyawa kimia pada ekstrak akan mengganggu proses isolasi. Oleh karena itu

dilakukan penguapan kadar air dengan perlakuan dimasukkan dalam desikator

yang berisi batu gamping. Hasil yang diperoleh adalah berat ekstrak turun dari

sebanyak 65,9 g. Keuntungan menggunakan metode ini adalah menghindari

pemanasan dalam melakukan pemekatan sehingga kerusakan senyawa kimia yang

terkandung dalam ekstrak dapat diminimalisir.

3. Pemerian ekstrak bunga kenanga

Pada tahap ini, ekstrak yang dihasilkan diamati secara organoleptis.

Pengamatan organoleptis yang dilakukan pada ekstrak meliputi bentuk, warna,

rasa, dan bau. Bentuk yang dihasilkan cairan kental, warna hijau kehitaman, rasa

hambar, dan bau harum khas bunga kenanga.

D. Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak

Tahap selanjutnya adalah dilakukan optimasi fase gerak kromatografi lapis

tipis (KLT). Tujuan dilakukan optimasi fase gerak adalah untuk mendapatkan

hasil pemisahan yang baik dari senyawa-senyawa kimia yang terkandung pada

ekstrak. Prinsip kromatografi lapis tipis adalah pemisahan analit berdasarkan

interaksi dengan fase diam dan fase gerak pada suatu lempeng pemisahan.

Optimasi fase gerak dilakukan dengan melihat hasil pemisahan pada tiga

jenis fase gerak, yaitu n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v), etil asetat : asam formiat :

asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v), dan kloroform : metanol (7 : 3 v/v).

Ketiga jenis fase gerak tersebut secara berurutan bersifat relatif nonpolar, polar,

Gambar 3. Hasil optimasi fase gerak kromatografi lapis tipis ekstrak kenanga (A = n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v) ; B = kloroform : metanol (7 : 3 v/v); C= etil

asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100 : 11 : 11 : 20 v/v))

Tabel I. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v)

Rf UV 254 UV 366

0,72-0,76 Meredam Merah

0,80 - 0,84 Meredam Merah

Tabel II. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v)

Rf UV 254 UV 366

0,35 - 0,43 Meredam -

0,90 - 0,95 Meredam -

Tabel III. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak kloroform : metanol (7 : 3 v/v)

Rf UV 254 UV 366

0,50 - 0,60 Meredam Merah

0,70 - 0,75 Meredam -

Dari ketiga jenis fase gerak diatas, hasil pemisahan yang paling optimal

terjadi pada fase gerak kloroform : metanol (7 : 3 v/v) dimana terdapat 3 bercak

dengan Rf tidak terlalu tinggi maupun terlalu rendah. Selanjutnya, dilakukan

optimasi lanjutan dengan melakukan pemisahan dengan menggunakan fase gerak

kloroform : metanol (95 : 5 v/v) untuk menurunkan Rf yang terbentuk pada

pemisahan dengan fase gerak kloroform : metanol (7 : 3 v/v). Hasil pemisahan

paling optimum didapatkan menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5

v/v) yang dapat memisahkan 7 bercak dengan resolusi yang baik. Selain itu,

pemilihan fase gerak optimum didukung dengan panduan uji aktivitas

penangkapan radikal DPPH.

Gambar 4. Hasil optimasi fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) ( A= UV 254 nm; B= UV 366 nm; C= secara visual)

Tabel IV. Hasil faktor retardasi (Rf) kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak bunga kenanga dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

Rf Visual UV 254 UV 366 Keterangan

0,10 - 0,15 - Meredam Merah

muda

-

0,20 - 0,25 - Meredam Merah

muda

-

0,35 - 0,40 Hijau Meredam Merah -

0,45 - 0,55 Kuning Meredam - Warna kuning lama

kelamaan akan menghilang

0,60 - 0,65 - Meredam - -

0,70 - 0,76 - Meredam Merah -

0,77 - 0,80 - - Merah

E. Uji Kualitatif Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas DPPH Pada tahap ini dilakukan uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas

DPPH hasil pemisahan ekstrak pada 3 sistem fase gerak. Tiga sistem fase gerak

tersebut adalah n-heksana: etil asetat (2:3 v/v), kloroform : metanol (95 : 5 v/v),

etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v). Metode

DPPH dipilih karena merupakan metode yang relatif cepat, sensitif, dan mudah

untuk skrining senyawa yang memiliki kemampuan menangkap radikal bebas.

DPPH merupakan radikal bebas yang mampu bereaksi dengan senyawa - senyawa

yang mampu mendonorkan atom hidrogen. Hasil uji kualitatif penangkapan

Gambar 5. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH ( A= n-heksana: etil asetat (2:3 v/v); B= fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v); C= etil

asetat: asam formiat: asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v) )

Gambar 6. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH pada fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

Tabel V. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v)

Rf UV 254 UV 366 Hasil Waktu muncul

0,45 - 0,55 Meredam - Muncul bercak

berwarna kuning pudar

± 24 jam

0,60 - 0,65 Meredam - Muncul bercak

berwarna kuning pudar

± 60 menit

0,70 - 0,76 Meredam Merah Muncul bercak berwarna kuning

pekat

± 5 menit

Tabel VI. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak etil asetat: asam formiat: asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v)

Rf UV 254 UV 366 Hasil Waktu muncul

0,90 - 0,95 Meredam - Muncul bercak berwarna kuning

pekat

± 10 menit

Tabel VII. Hasil uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal DPPH fase gerak n-heksana: etil asetat (2:3 v/v)

Rf UV 254 UV 366 Hasil Waktu muncul

- - - - -

Adanya elektron yang tidak berpasangan akan membuat DPPH

memberikan serapan yang kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi

berpasangan maka absorbansi DPPH akan menurun. Senyawa yang memiliki

aktivitas antioksidan dapat mengubah warna DPPH yang semula ungu menjadi

Berdasarkan hasil uji kualitatif penangkapan radikal DPPH, tampak bahwa

hasil pemisahan dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) merupakan

fase gerak yang optimum karena terdapat 3 bercak berwarna kuning dimana salah

satu bercak dengan Rf antara 0,70 - 0,76 merupakan bercak yang diperkirakan

memiliki kemampuan terkuat dalam menangkap radikal DPPH. Bercak berwarna

kuning tersebut juga tampak pada hasil pemisahan dengan fase gerak etil asetat :

asam formiat : asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v) sebanyak 1 bercak

sedangkan pada pemisahan dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v)

tidak tampak ada bercak kuning. Hal ini juga menjadi dasar pertimbangan dalam

menentukan fase gerak optimum.

Fase gerak etil asetat:asam formiat: asam asetat glasial : air (100:11:11:20

v/v) memisahkan senyawa yang bersifat polar yang ada pada ekstrak namun

hanya terdapat satu bercak kuning pada Rf yang tinggi yang menandakan

pemisahan yang terjadi kurang optimal. Isolasi senyawa – senyawa yang bersifat terlalu polar seperti ini akan sulit untuk dilakukan. Tidak adanya bercak kuning

pada pemisahan dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (2 : 3 v/v) kemungkinan

disebabkan karena senyawa yang terelusi adalah senyawa - senyawa lipid dan

klorofil. Beberapa hal tadi memperkuat bahwa fase gerak kloroform : metanol (95

: 5 v/v) merupakan fase gerak optimum dalam penelitian.

F. Uji Kualitatif Aktivitas UV Protection

Uji kualitatif aktivitas UV protection pada ekstrak didahului dengan melakukan optimasi intensitas sinar UV. Tujuan dilakukan optimasi intensitas

sinar UV adalah untuk memudahkan pengamatan yang dilakukan oleh peneliti.

Jarak lampu UV menuju pelat KLT merupakan variabel yang diubah-ubah sebab

semakin dekat jarak lampu UV akan semakin kuat intensitas sinarnya sehingga

akan merusak warna �-karoten dengan cepat dan merubah warnanya menjadi pudar.

Gambar 7. Optimasi intensitas sinar UV

Hasil optimasi menunjukkan bahwa jarak optimum yang diperoleh adalah

50 cm (intensitas sedang) dengan rata-rata intensitas sinarnya 15,01 Lux. Pada

kondisi ini warna �-karoten tidak memudar terlalu lambat ataupun terlalu cepat seperti yang ditunjukkan pada hasil optimasi pada jarak 100 cm dan 35 cm.

Kondisi optimum akan mempermudah peneliti melakukan pengamatan perubahan

warna menggunakan parameter warna. Parameter warna (terlampir) dibuat dengan

mempertimbangkan gradasi warna dari kuning oranye hingga memudar. 0 1 2 3 4 5 6 7

0 1 3 6 9 12 15

n o m o r p ar am e te r waktu (menit)

intensitas rendah 5, 89 Lux

intensitas sedang 15,01 Lux

c. Gambar uji kualitatif isolat 2(A= massa uji 50 µg; B= massa uji 100 µg; C= massa uji 200 µg)

d. Gambar uji kualitatif isolat 3(A= massa uji 50 µg; B= massa uji 100 µg; C= massa uji 200 µg)

Lampiran 18. Penimbangan isolat hasil kromatografi kolom a. Penimbangan isolat 1

Berat (g)

Flakon 18,5485

Flakon + isi 18,5695

Isi 0,021

Rendemen isolat 1 = ,

, x 100% = 6,61 % b/b b. Penimbangan isolat 2

Berat (g)

Flakon 18,0361

Flakon + isi 18,0397

Isi 0,0036

Rendemen isolat 2 = ,

, x 100% = 1,13 % b/b c. Penimbangan isolat 3

Berat (g)

Flakon 18,0581

Flakon + isi 18,0601

Isi 0,002

Rendemen isolat 3 = ,

d. Penimbangan isolat 4

Berat (g)

Flakon 15,1603

Flakon + isi 15,1609

Isi 0,0006

Rendemen isolat 4 = ,

, x 100% = 0,19 % b/b e. Penimbangan isolat 5

Berat (g)

Flakon 11,0735

Flakon + isi 11,0737

Isi 0,0002

Rendemen isolat5 = ,

, x 100% = 0,06 % b/b f. Penimbangan isolat 6

Berat (g)

Flakon 10,9426

Flakon + isi 10,9430

Isi 0,0004

Rendemen isolat6 = ,

g. Penimbangan isolat 7

Berat (g)

Flakon 10,9568

Flakon + isi 10,9569

Isi 0,0001

Rendemen isolat7 = ,

, x 100% = 0,03 % b/b h. Penimbangan isolat 8

Berat (g)

Flakon 12,3684

Flakon + isi 12,3685

Isi 0,0001

Rendemen isolat8 = ,

, x 100% = 0,03 % b/b i. Penimbangan isolat 9

Berat (g)

Flakon 12,2387

Flakon + isi 12,2392

Isi 0,0005

Rendemen isolat9 = ,

j. Penimbangan isolat 10

Berat (g)

Flakon 8,1996

Flakon + isi 8,1997

Isi 0,0001

Rendemen isolat10 = ,

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Senyawa Aktif Penangkap Radikal Bebas DPPH, UV protection, dan Antibakteri Ekstrak Bunga Kenanga (Cananga odorata

(Lmk.) Hook.F. & Thoms” memiliki nama lengkap Surya Adhi Nugraha lahir di Yogyakarta, 3 September 1993 dari pasangan A. Budi Sugiharjo dan F. Any Hartati. Penulis telah menyelesaikan pendidikan di TK Mutiara Persada pada tahun 1997 hingga 1999. Penulis melanjutkan pendidikan dasar di SD Tarakanita Bumijo pada tahun 1999 hingga 2005, kemudian penulis melanjutkan pendidikan menengah di SMP Stella Duce 1 pada tahun 2005 hingga 2008 dan SMA Kolese De Britto Yogyakarta pada tahun 2008 hingga 2011. Penulis melanjutkan pendidikan perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2011 hingga 2015. Selama menjadi mahasiswa Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta, penulis cukup aktif dalam kegiatan kemahasiswaan, kepanitiaan dan kegiatan lain yang terdapat di dalam maupun di luar Universitas Sanata Dharma antara lain: sebagai peserta Program Kreativitas Mahasiswa Kewirausausahaan (PKM-K) lolos didanai Hibah Direktorat Pendidikan Tinggi (Dikti) dengan judul “Mollusca Crispy Sebagai Camilan Sumber Protein dan Peningkatan Kesehatan Otak” (2014), panitia Donor Darah Jaringan Mahasiswa Kesehatan Indonesia (2011), Divisi Keuangan ISMAFARSI JOGLOSEPUR (2012-2014), panitia Titrasi (2012), panitia Paingan Festival (2012), Kaderisasi Kepengurusan ISMAFARSI Komisariat Sanata Dharma (2012/2013), Ketua Latihan Kepemimpinan Tingkat I Fakultas Farmasi USD (2013), Ketua Umum Titrasi (2013); dan Asisten Praktikum Farmakognosi Fitokimia (2014).