Isolasi dan identifikasi golongan senyawa aktif penangkap radikal bebas, antibakteri, dan uv protection ekstrak rimpang kunyit (curcuma longa l.).

INTISARI

Perawatan kecantikan menggunakan lulur secara tradisional telah digunakan sejak zaman nenek moyang dengan komponen utama rimpang kunyit (Curcuma longa L.). Beberapa penelitian pada rimpang kunyit sering menyebutkan kandungan pada kunyit adalah kurkuminoid yang memiliki aktivitas terapetik yang luas, sehingga penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui golongan senyawa selain kurkuminoid yang memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection pada ekstrak rimpang kunyit.

Rimpang kunyit diekstraksi dengan pelarut etanol 90% v/v. Uji pendahuluan dilakukan secara kualitatif dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Uji aktivitas sebagai penangkap radikal bebas dilakukan dengan metode DPPH, antibakteri dengan metode bioautografi kontak, dan UV protection dengan metode

inhibition of bleaching of -carotene. Senyawa aktif hasil uji kualitatif tersebut diisolasi dengan kromatografi kolom. Isolat yang diperoleh tersebut kemudian kembali diuji aktivitas penangkap radikal bebas dilakukan dengan metode DPPH, antibakteri dengan metode Kirby – Bauer, dan UV protection dengan metode

inhibition of bleaching of -carotene.

Hasil penelitian menunjukkan adanya senyawa yang memiliki aktvitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection. Isolat pertama yang diperoleh memiliki aktivitas penangkap radikal bebas dan UV protection, sedangkan isolat kedua yang diperoleh memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection. Kedua isolat tersebut berdasarkan hasil identifikasi merupakan golongan senyawa terpenoid.

Kata kunci :ekstrak rimpang kunyit, bercak aktif, isolasi, identifikasi golongan senyawa.

ABSTRACT

Main component of lulur is turmeric rhizome (Curcuma longa L.). The major compounds in turmeric are curcuminoids which have been researched and it had large therapeutic activity. This research aimed to find out the other substances of turmeric extract besides curcuminoids which has activity as free radical scavenger, antibacterial, and UV protection.

Turmeric was extracted with ethanol 90% v/v. Preliminary test completed qualitatively by Thin Layer Chromatography (TLC) method. Activity test as a free radical scavenger has been done by applying DPPH method, antibacterial activity with bioautography assay, and UV protection with inhibition of bleaching of -carotene assay. The active substances isolated with column chromatography. Isolates were tested again as free radical scavenger with DPPH method, antibacterial activity with Kirby – Bauer method, and UV protection with inhibition of bleaching of -carotene assay.

The result found active isolates with free radical scavenger activity, antibacterial, and UV protection. The first isolate has free radical scavenger and UV protection, whereas the second isolate has free radical scavenger, antibacterial, and UV protection. Both isolates identified as terpenoid.

Keywords : turmeric extract, active zone, isolation, identification of active substance.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS, ANTIBAKTERI, DAN UV PROTECTION EKSTRAK RIMPANG KUNYIT (Curcuma longa L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan Oleh: Elyn Prameswari NIM: 118114110

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

i

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS, ANTIBAKTERI, DAN UV PROTECTION EKSTRAK RIMPANG KUNYIT (Curcuma longa L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Diajukan Oleh: Elyn Prameswari NIM: 118114110

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

ii

iii

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Kupersembahkan Skripsi ini untuk : Tuhan Yesus, sang Penyelamat yang selalu membimbingku

Kedua orang tuaku Kedua kakakku Almamaterku Aku percaya pada keberuntungan dan aku menyadari semakin

aku bekerja keras semakin banyak keberuntungan yang aku miliki -Thomas Jefferson-

v

vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

vii PRAKATA

Puji syukur dan terima kasih kepada Tuhan Yesus Kristus atas segala anugerah dan berkat – Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi berjudul “Isolasi dan Identifikasi Golongan Senyawa Aktif Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV Protection Ekstrak Rimpang Kunyit (Curcuma longa L.)”. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Penulis mengalami banyak kesulitan dan masalah dalam menyelesaikan skripsi ini. Tetapi dengan adanya bantuan, dukungan, bimbingan, kritik, dan saran dari berbagai pihak, akhirnya penulis mampu menghadapi segala kesulitan dan masalah yang menghadang. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis ingin mengucapkan terima kasih atas segala bantuan yang telah diberikan kepada:

1. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2. Dr. rer. nat. Yosi Bayu Murti, Apt. selaku dosen pembimbing dan dosen penguji atas kesabaran, bimbingan, arahan, masukan, perhatian, semangat dan waktu yang diberikan selama penelitian dan penyusunan skripsi ini.

3. Dr. Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan waktu, kritik, dan saran yang bermanfaat untuk skripsi ini. 4. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. selaku dosen penguji yang telah

memberikan waktu, kritik, dan saran yang bermanfaat untuk skripsi ini. 5. Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang selalu mendukung, membantu, dan memberikan semangat dalam menyelesaikan penelitian skripsi ini.

6. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku DPA yang telah mendukung selama proses perkuliahan sampai proses pembuatan skripsi ini.

7. Papa, Mama, dan kakak Getty Rajasa atas kasih sayang dan dukungan yang telah diberikan kepada penulis, baik secara moral maupun materil.

8. Vega Citrawati dan Leonardo Yoppy Eka Noviyanto selaku kakak dan sahabat atas kasih sayang, dukungan, kritik, saran, canda tawa, dan semangat yang diberikan kepada penulis.

9. Segenap Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 10. Segenap Laboran Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

viii

11. Tim skripsi dan sahabat penulis (Setio Agustin, Agustine Kurniawaty, Surya Adhi Nugraha, Skolastika Feranda) atas kerjasama yang telah dilewati bersama selama penelitian ini.

12. Veve, Shiro, kak Reny, Marshella, dan Ratna selaku teman dan pemberi semangat bagi penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

13. Teman – teman laskar intan: Nella, Iga, Yunika, Natry, mbak Wahyu, dan Deivi atas semangat, dukungan, kegilaan, canda tawa, kritik, dan sarannya. 14. Teman – teman Fakultas Farmasi angkatan 2011 atas kerjasama, canda tawa,

dan memberi semangat.

15. Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu atas bantuannya dalam pengadaan bahan baku simplisia rimpang kunyit.

16. Semua pihak yang telah memberikan dukungan dan bantuan yang tidak dapat disebutkan satu – persatu.

Penulis menyadari bahwa dalam penyelesaian skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis memohon maaf apabila terdapat hal – hal yang kurang berkenan, tidak lupa penulis juga mengharapkan kritik dan saran yang membangun.

Akhir kata penulis berharap tugas akhir ini dapat bermanfaat untuk berbagai pihak yang membutuhkan dan menjadi sumbangan bagi ilmu pengetahuan.

Penulis

ix DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii

HALAMAN PENGESAHAN ... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... v

LEMBAR PERNYATAAN PUBLIKASI KARYA ... vi

PRAKATA... ... vii

DAFTAR ISI...ix

DAFTAR TABEL ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiv

INTISARI... ... xv

ABSTRACT ...xvi

BAB I PENGANTAR ... 1

A. Latar Belakang ... 1

1. Permasalahan ... 2

2. Keaslian penelitian ... 3

3. Manfaat penelitian ... 5

B. Tujuan Penelitian ... 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA... 7

A. Kunyit ... 7

1. Klasifikasi tanaman ... 7

2. Deskripsi tanaman ... 8

3. Kandungan kimia kunyit ... 8

4. Khasiat dan kegunaan kunyit ... 9

B. Ekstraksi ... 10

1. Maserasi ... 10

2. Triturasi ... 11

C. Kromatografi ... 12

1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)... 12

2. Kromatografi kolom ... 14

D. Antioksidan ... 15

1. Reactive Oxygen Species (ROS) ... 15

2. Senyawa dan golongan senyawa antioksidan... 16

x

E. Antibakteri ... 19

1. Bakteri ... 19

2. Mekanisme antibakteri ... 20

3. Resistensi bakteri... 20

4. Golongan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri ... 21

5. Uji kualitatif antibakteri dengan metode bioautografi kontak ... 21

6. Uji daya antibakteri dengan metode Kirby – Bauer ... 23

F. UV Protection ... 24

1. Radiasi ultraviolet pada kulit... 24

2. Tabir surya... 24

3. Uji aktivitas tabir surya dengan metode inhibition of bleaching of -carotene ... 25

G. Landasan Teori ... 26

H. Hipotesis ... 27

BAB III METODE PENELITIAN... 28

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 28

B. Definisi Operasional ... 28

C. Bahan dan Alat Penelitian ... 28

1. Bahan penelitian ... 28

2. Alat penelitian ... 29

D. Tatacara Penelitian ... 29

1. Pengumpulan dan penyiapan bahan ... 29

2. Ekstraksi ... 30

3. Optimasi fase gerak pada ekstrak kental rimpang kunyit ... 31

4. Identifikasi golongan senyawa pada ekstrak kental rimpang kunyit ... 32

5. Uji kualitatif penangkap radikal bebasekstrak rimpang kunyit ... 32

6. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak rimpang kunyit... 33

7. Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak rimpang kunyit ... 36

8. Isolasi senyawa yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection ... 37

9. Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas dan UV protection pada isolat ... 42

10. Uji daya antibakteri dengan metode Kirby – Bauer ... 43

11. Identifikasi golongan senyawa pada isolat ... 44

xi

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 46

A. Pengumpulan dan Penyiapan Bahan ... 46

1. Pengumpulan bahan ... 46

2. Susut pengeringan simplisia ... 47

3. Penyiapan bahan ... 48

B. Ekstrak Kental Rimpang Kunyit ... 49

1. Ekstraksi ... 49

2. Susut pengeringan ekstrak ... 51

C. Optimasi Fase Gerak Ekstrak Kental Rimpang Kunyit ... 51

D. Identifikasi Golongan Senyawa dengan Reagen Semprot pada Ekstrak Kental Rimpang Kunyit ... 54

E. Uji Aktivitas Penangkap Radikal Bebas DPPH, Antibakteri, dan UV Protection pada Ekstrak Kental Rimpang Kunyit ... 58

1. Uji aktivitas penangkap radikal bebas ... 58

2. Uji aktivitas antibakteri dengan metode bioautografi kontak ... 60

3. Uji aktivitas UV protection dengan metode inhibition of bleaching of - carotene ... 67

F. Isolasi Senyawa yang Memiliki Aktivitas Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV Protection ... 72

G. Aktivitas Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV Protection pada Isolat ... 76

1. Aktivitas penangkap radikal bebas DPPH pada isolat ... 76

2. Aktivitas antibakteri pada isolat ... 77

3. Aktivitas UV protection pada isolat ... 81

H. Identifikasi Isolat Aktif ... 83

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 85

A. Kesimpulan ... 85

B. Saran ... 85

DAFTAR PUSTAKA ... 86

LAMPIRAN... ... 91

xii

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil identifikasi golongan senyawa pada ekstrak kental

rimpang kunyit... 55

Tabel II. Kisaran nilai Rf ekstrak kunyit dengan metode bioautografi kontak ... 62

Tabel III. Hasil uji aktivitas UV protection ekstrak rimpang kunyit... 71

Tabel IV. Profil KLT isolasi senyawa dengan fase gerak kloroform ... 74

Tabel V. Hasil aktivitas UV protection pada isolat ... 81

Tabel VI. Identifikasi golongan senyawa pada isolat ... 83

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Molekul DPPH (radikal)... 18

Gambar 2. Struktur -carotene ... 25

Gambar 3. Hasil optimasi fase gerak pada deteksi UV 254 nm ... 52

Gambar 4. Hasil optimasi fase gerak pada deteksi UV 254 nm ... 53

Gambar 5. Ekstrak rimpang kunyit pada deteksi secara fisik ... 54

Gambar 6. Ekstrak rimpang kunyit dengan reagen semprot ... 55

Gambar 7. Perbandingan nilai Rf antara standar kurkumin dan ekstrak rimpang kunyit... 58

Gambar 8. Hasil uji kualitatif penangkap radikal bebas DPPH ... 59

Gambar 9. Hasil uji antibakteri dengan bioautografi kontak ... 62

Gambar 10. Kontrol media ... 65

Gambar 11. Hasil kontrol pertumbuhan bakteri ... 66

Gambar 12. Hasil kontrol positif amoksisilin ... 66

Gambar 13. Kurva optimasi intensitas cahaya ... 69

Gambar 14. Perbandingan profil KLT ekstrak rimpang kunyit dan hasil triturasi ... 72

Gambar 15. Perbandingan profil KLT pada UV 254 nm ... 73

Gambar 16. Perbandingan profil KLT pada UV 366 nm ... 73

Gambar 17. Alur isolasi senyawa aktif ekstrak rimpang kunyit ... 75

Gambar 18. Hasil uji kualitatif penangkap radikal bebas pada isolat setelah 2 jam penyemprotan ... 76

Gambar 19. Hasil uji antibakteri ... 78

Gambar 20. Kontrol media ... 79

Gambar 21. Kontrol pertumbuhan bakteri S. aureus... 80

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat determinasi rimpang kunyit ... 91

Lampiran 2. Sertifikat hasil uji bakteri E. coli dan S. aureus ... 93

Lampiran 3. Foto simplisia kering rimpang kunyit... 95

Lampiran 4. Perhitungan susut pengeringan simplisia rimpang kunyit ... 96

Lampiran 5. Perhitungan rendemen ekstrak rimpang kunyit ... 98

Lampiran 6. Susut pengeringan ekstrak ... 99

Lampiran 7. Optimasi fase gerak kromatografi lapis tipis ... 101

Lampiran 8. Isolasi senyawa ... 103

Lampiran 9. Identifikasi golongan senyawa dengan reagen semprot pada isolat ... 107

Lampiran 10. Uji kualitatif penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri ... 109

xv INTISARI

Perawatan kecantikan menggunakan lulur secara tradisional telah digunakan sejak zaman nenek moyang dengan komponen utama rimpang kunyit (Curcuma longa L.). Beberapa penelitian pada rimpang kunyit sering menyebutkan kandungan pada kunyit adalah kurkuminoid yang memiliki aktivitas terapetik yang luas, sehingga penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui golongan senyawa selain kurkuminoid yang memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection pada ekstrak rimpang kunyit.

Rimpang kunyit diekstraksi dengan pelarut etanol 90% v/v. Uji pendahuluan dilakukan secara kualitatif dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Uji aktivitas sebagai penangkap radikal bebas dilakukan dengan metode DPPH, antibakteri dengan metode bioautografi kontak, dan UV protection dengan metode

inhibition of bleaching of -carotene. Senyawa aktif hasil uji kualitatif tersebut diisolasi dengan kromatografi kolom. Isolat yang diperoleh tersebut kemudian kembali diuji aktivitas penangkap radikal bebas dilakukan dengan metode DPPH, antibakteri dengan metode Kirby – Bauer, dan UV protection dengan metode

inhibition of bleaching of -carotene.

Hasil penelitian menunjukkan adanya senyawa yang memiliki aktvitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection. Isolat pertama yang diperoleh memiliki aktivitas penangkap radikal bebas dan UV protection, sedangkan isolat kedua yang diperoleh memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection. Kedua isolat tersebut berdasarkan hasil identifikasi merupakan golongan senyawa terpenoid.

Kata kunci :ekstrak rimpang kunyit, bercak aktif, isolasi, identifikasi golongan senyawa.

xvi ABSTRACT

Main component of lulur is turmeric rhizome (Curcuma longa L.). The major compounds in turmeric are curcuminoids which have been researched and it had large therapeutic activity. This research aimed to find out the other substances of turmeric extract besides curcuminoids which has activity as free radical scavenger, antibacterial, and UV protection.

Turmeric was extracted with ethanol 90% v/v. Preliminary test completed qualitatively by Thin Layer Chromatography (TLC) method. Activity test as a free radical scavenger has been done by applying DPPH method, antibacterial activity with bioautography assay, and UV protection with inhibition of bleaching of -carotene assay. The active substances isolated with column chromatography. Isolates were tested again as free radical scavenger with DPPH method, antibacterial activity with Kirby – Bauer method, and UV protection with inhibition of bleaching of -carotene assay.

The result found active isolates with free radical scavenger activity, antibacterial, and UV protection. The first isolate has free radical scavenger and UV protection, whereas the second isolate has free radical scavenger, antibacterial, and UV protection. Both isolates identified as terpenoid.

Keywords : turmeric extract, active zone, isolation, identification of active substance.

1 BAB I PENGANTAR A.Latar Belakang

Perawatan kecantikan secara tradisional merupakan salah satu manifestasi kebudayaan yang diturunkan secara turun menurun dan telah menjadi satu bentuk seni kecantikan. Perawatan kulit merupakan bagian dari perawatan kecantikan yang telah dikenal sejak jaman dahulu kala dan telah menjadi bagian dari kebudayaan masyarakat. Oleh karena itu, trend yang popular saat ini adalah

back to nature yaitu dengan menggunakan tumbuh – tumbuhan atau herbal sebagai bahan utama dalam perawatan kecantikan. Hal ini disebabkan karena bahan – bahan alami tersebut lebih dapat diterima oleh tubuh dibandingkan bahan sintetik (Tarigan, Zuhra, dan Sihotang, 2008).

Salah satu perawatan tubuh yang sering dilakukan adalah dengan luluran. Lulur telah dikenal sejak nenek moyang terutama oleh keluarga keraton sebagai perawatan kecantikan kulit secara tradisional. Hal ini dilakukan karena ingin memiliki kulit yang halus dan mulus agar tetap terjaga kebersihan dan kesehatannya, lulur cocok digunakan untuk perawatan kulit tubuh bagi yang tinggal di daerah tropis karena berudara panas, yang menyebabkan kulit tubuh dengan mudah terkena sengatan matahari dan kotoran keringat. Bahan utama lulur yang digunakan oleh nenek moyang adalah dengan memanfaatkan rimpang kunyit yang dibuat dengan cara sederhana.

Kunyit yang telah dihaluskan menjadi bubuk akan menghasilkan minyak yang mengandung antioksidan, sehingga lulur dapat menghaluskan kulit dan membuat kulit lebih cerah. Kunyit juga bersifat mendinginkan, membersihkan, menghilangkan bau yang tidak sedap, dan bersifat antibakteri. Oleh karena itu sering digunakan sebagai kosmetik tradisional untuk perawatan kesehatan kulit wajah dan tubuh.

Ekstrak etanolik rimpang kunyit (Curcuma longa L.) memiliki kandungan kurkumin dan flavonoid yang merupakan golongan senyawa fenolik, dan terpenoid (Chhetri, Yogol, Sherchan, Anupa, Mansoor, dan Thapa, 2008). Saat ini, kunyit juga digunakan dalam formulasi sebagai tabir surya (Ganpati, Bhaurao, Iranna, Dilip, dan Nilkanth, 2011). Oleh sebab itu, pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection

pada kunyit. Penelitian ini diawali dengan pembuatan ekstrak rimpang kunyit kemudian dilakukan uji kualitatif dengan menggunakan lempeng KLT untuk mengetahui zona bercak yang memiliki aktivitas untuk selanjutnya diisolasi dengan kromatografi kolom dan dilanjutkan dengan uji aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection secara kualitatif pada isolat yang didapatkan.

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, permasalahan yang ditimbulkan adalah:

a. Apakah ekstrak rimpang kunyit memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection?

b. Golongan senyawa apa yang bertanggung jawab terhadap aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection selain kurkuminoid yang terkandung pada ekstrak rimpang kunyit?

2. Keaslian penelitian

Sejauh pengamatan penulis, penelitian berjudul “Isolasi dan Identifikasi Golongan Senyawa Aktif Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV

Protection Ekstrak Rimpang Kunyit (Curcuma longa L.)” belum pernah dilakukan. Penelitian mengenai rimpang kunyit yang terkait aktivitas antibakteri pernah dilakukan oleh Naz, Jabeen, Ilyas, Manzoor, Azlam, dan Ali (2010) yang menguji tentang aktivitas antibakteri pada kurkuminoid dan minyak atsiri dari rimpang kunyit terhadap bakteri Bacillus subtilis, Bacillus macerans, Bacillus licheniformis dan Azotobacter dengan menggunakan metode difusi sumuran. Pada penelitian ini, kurkuminoid diperoleh dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut etanol, sedangkan minyak atsiri diekstraksi dengan cara hidrodistilasi yang kemudian didilusi dengan menggunakan metanol. Penelitian lain terkait dengan aktivitas antibakteri juga pernah dilakukan oleh Helen, Prinitha, Sree, Abisha, dan Jacob (2012) yang menguji minyak atsiri, ekstrak metanol, ekstrak aseton, dan ekstrak n-heksan rimpang kunyit terhadap bakteri Gram positif, Gram negatif, serta fungi dengan metode Kirby – Bauer. Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa berbagai macam ekstrak rimpang kunyit tersebut memiliki daya antibakteri.

Aktivitas antioksidan rimpang kunyit pernah dilakukan oleh Choi (2009) dengan menggunakan ekstrak metanolik rimpang kunyit yang diuji secara in vitro

menggunakan metode DPPH, ABTS, dan FRAP menunjukkan bahwa ekstrak metanolik rimpang kunyit dapat digunakan sebagai sumber antioksidan. Penelitian terkait juga dilakukan oleh Nahak dan Sahu (2011) tentang evaluasi aktivitas antioksidan pada ekstrak etanolik dari lima spesies kurkuma dan kandungan fenolik total dengan menggunakan metode DPPH.

Revathy, Elumalai, Benny, dan Antony (2011) melakukan penelitian mengenai isolasi, pemurnian, dan identifikasi kurkuminoid dari rimpang kunyit dengan kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi pada penelitian ini adalah n-heksan, kloroform, etil asetat, metanol, dan aseton yang selanjutnya pemisahan kurkuminoid diuji dengan KLT menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95:5 v/v). Pemisahan terbaik ditunjukkan oleh ekstrak aseton yang selanjutnya masing – masing kurkuminoid tersebut diisolasi dengan menggunakan kromatografi kolom dan dilakukan pemurnian menggunakan HPLC.

Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian – penelitian sebelumnya adalah simplisia kering rimpang kunyit diperoleh dari B2P2TOOT. Ekstraksi dilakukan dengan pelarut etanol 90% v/v yang kemudian dilakukan uji aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection secara kualitatif dengan kromatografi lapis tipis untuk mengetahui zona bercak yang memiliki aktivitas tersebut, yang selanjutnya diisolasi dengan kromatografi kolom. Hasil isolasi yang diperoleh tersebut kemudian dilakukan uji aktivitas kembali dengan metode DPPH semprot untuk uji penangkap radikal bebas, metode Kirby - Bauer untuk uji antibakteri¸ dan menggunakan metode inhibition of bleaching of –

carotene untuk uji UV protection. Selain itu, pada penelitian ini tidak berfokus pada kurkuminoid seperti pada penelitian – penelitian sebelumnya melainkan pada senyawa lain yang terdapat pada rimpang kunyit yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection.

3. Manfaat penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan memiliki manfaat sebagai berikut:

a. Manfaat teoritis : Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan tentang aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection ekstrak rimpang kunyit dan golongan senyawa yang memiliki aktivitas tersebut.

b. Manfaat praktis : Penelitian ini diharapkan mampu membuktikan khasiat rimpang kunyit terhadap penggunaannya sebagai kosmetik tradisional sehingga tidak hanya dimanfaaatkan pada lulur, tapi juga pada sediaan kosmetik tradisional yang lain.

B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum

Membuktikan bahwa ekstrak rimpang kunyit memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection.

2. Tujuan khusus

a. Mengetahui ekstrak rimpang kunyit memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection.

b. Mengetahui golongan senyawa selain kurkuminoid yang bertanggung jawab terhadap aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV

7 BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA A.Kunyit

1. Klasifikasi tanaman

Tanaman kunyit menurut United States Department of Agriculture (USDA) diklasifikasikan sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta Division : Magnoliophyta Class : Liliopsida Subclass : Zingiberidae Order : Zingiberales Family : Zingiberaceae

Genus : Curcuma

Species : Curcuma longa L.

Nama lain dari C. longa menurut United States Department of Agriculture (USDA) adalah Curcuma domestica Valeton.

Kunyit (C. longa) di berbagai daerah di Indonesia dikenal dengan nama kunir (Jawa), Hunik (Batak), kunyir (Lampung), temu kuning, kunir (Jawa), koneng (Sunda), konyet atau temu koneng (Madura), kunidi (Sulawesi Utara), kuminu (Ambon), rame (Irian) (Pangkalan Ide, 2011).

2. Deskripsi tanaman

Kunyit adalah tanaman tema tahunan. Kunyit merupakan tumbuhan daerah subtropis sampai tropis dan tumbuh subur di dataran rendah lebih kurang 90 meter sampai ketinggian 2000 meter di atas permukaan laut. Kunyit memiliki batang pohon semu dan basah. Daunnya mirip dengan tumbuh – tumbuhan jenis pisang – pisangan. Pelepah – pelepah daun kunyit yang dominan berwarna hijau membentuk batang dengan helaian daun berbentuk bulat telur. Rimpangnya memiliki banyak cabang dengan kulit luarnya berwarna jingga kecoklatan. Buah daging rimpang kunyit berwarna merah jingga kekuning – kuningan. Tinggi tumbuhan kunyit mampu mencapai 1 meter dan bunganya muncul dari pucuk batang semu dengan panjang sekitar 10 – 15 cm dan berwarna putih (Thomas, 1989).

3. Kandungan kimia kunyit

Kunyit mengandung protein (6,3%), lemak (5,1%), mineral (3,5%), karbohidrat (69,4%), dan air (23,1%). Minyak atsiri (5 – 8%) yang diperoleh dengan cara destilasi uap mengandung α – phellanderene (1%), sabiene (0,6%), cineol (1%), borneol (0,5%), zingiberene (25%), dan seskuiterpenes (53%). Kandungan kurkuminoid pada kunyit yaitu kurkumin (77%), desmetoksikurkumin (18%), dan bis – desmetoksikurkumin (5%). Kurkumin inilah yang memberi warna kuning pada kunyit dan diduga memiliki aktifitas terapetik terbesar pada kunyit. Kurkumin bersifat hidrofobik dan mudah larut dalam dismethylsulfoxide, aseton, etanol, dan minyak. Selain itu, kurkumin memiliki nilai absorbansi maksimum pada 425 nm. Warna kunyit/ kurkumin dapat berubah dari kuning

menjadi merah gelap apabila berada pada kondisi yang asam (Rathaur, Raja, Ramteke, dan John, 2012).

4. Khasiat dan kegunaan kunyit

Kunyit telah digunakan di India selama lebih dari 6000 tahun sebagai obat, kosmetik, bumbu masak, pewarna, dan sebagainya (Rathaur, et al., 2012). Di Indonesia, rimpang kunyit digunakan sebagai bumbu masak, sementara di Eropa kunyit dipergunakan sebagai bahan baku kosmetika atau perwarna makanan (Thomas, 1989). Selain itu, pengobatan tradisional Cina juga telah menggunakan kunyit selama lebih dari 1000 tahun terutama untuk mengobati limpa, liver, dan sakit perut. Kunyit juga digunakan untuk menstimulasi dan menurunkan tekanan darah, mengurangi rasa sakit pada bagian abdominal, antibiotik, anti virus dan analgesik (Rathaur, et al., 2012).

Kunyit juga dapat memiliki kemampuan sebagai bahan pengawet makanan melalui mekanisme antioksidannya. Tidak hanya digunakan sebagai bumbu dapur, kunyit juga dapat digunakan sebagai pengobatan tradisional untuk anoreksia, batuk, luka pada penderita diabetes, penyakit hepar, reumatik, sinusitis, dan lain – lain. Kunyit memiliki efek biologis yang luas, termasuk didalamnya yaitu sebagai anti – inflamasi, antioksidan, anti – karsinogenik, anti – mutagenik, anti – koagulan, anti – fertilitas, anti – diabetes, antibakteri, anti – fungal, anti – protozoa, anti fibrotik, anti – tukak lambung, dan hipokolesteremia (Rathaur, et al., 2012).

Ekstrak rimpang kunyit menunjukkan aktivitas antioksidan yang signifikan. Hasil studi ini menunjukkan bahwa kunyit memiliki kemampuan untuk

menangkap radikal bebas, mengurangi besi kompleks, dan menghambat peroksidasi (Tilak, Banerjee, Mohan, Devasagayam, 2004).

B.Ekstraksi 1. Maserasi

Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair yang dibuat dengan penyari simplisia menurut cara yang cocok, di luar pengaruh cahaya matahari langsung. Cairan penyari yang sering digunakan adalah air, eter, etanol, atau campuran etanol dan air (Deputi Bidang Pengawasan Obat Tradisional, Kosmetik, dan Produk Komplemen, 2010).

Parameter – parameter dasar yang mempengaruhi kualitas sebuah ekstrak yaitu: bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan awal, cairan penyari yang digunakan untuk ekstraksi, dan prosedur ekstraksi. Bagian tanaman yang digunakan untuk ekstraksi dapat dari berbagai macam bagian tanaman seperti dahan, ranting, daun, bunga, akar, buah, biji, dan lain – lain (Tiwari, Kumar, Kaur, Kaur, dan Kaur, 2011). Cairan penyari yang digunakan untuk ekstraksi harus memenuhi kriteria murah, mudah diperoleh, stabil secara fisika dan kimia, tidak toksik, netral, tidak mudah terbakar, selektif yang artinya dapat menarik zat berkhasiat yang dikehendaki (Depkes RI, 1986). Pemilihan prosedur ekstraksi didasarkan pada lamanya waktu ekstraksi, cairan penyari yang digunakan, pH cairan penyari, temperatur, ukuran partikel jaringan tanaman, dan perbandingan antara pelarut dan sampel (Tiwari, et al., 2011).

Maserasi adalah salah satu bentuk ekstraksi yang dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dengan cairan penyari dalam suatu wadah selama

beberapa hari. Proses yang mendasari maserasi adalah cairan penyari akan masuk ke dalam sel melewati dinding sel sehingga isi sel akan larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan tergantikan oleh cairan penyari yang konsentrasinya rendah. Peristiwa tersebut berulang hingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Maserasi banyak digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari dan tidak mengandung zat yang mudah mengembang dalam cairan penyari (Depkes RI, 1986).

2. Triturasi

Triturasi merupakan salah satu bentuk teknik pemurnian suatu senyawa. Pada umumnya pelarut yang bersifat non – polar seperti n – heksan, n – pentana, dietil eter, digunakan untuk menghilangkan senyawa – senyawa pengotor yang bersifat non – polar. Hal ini didasarkan pada prinsip “like dissolves like” yaitu

senyawa yang bersifat non – polar pada umumnya akan larut pada senyawa non – polar dan tidak larut pada senyawa polar (Zala, Patel, Patel, Parmar, dan Sen, 2012).

Pada kondisi tertentu untuk dapat memperoleh larutan senyawa yang diinginkan tidak hanya dapat diperoleh dengan pelarut tunggal saja, akan tetapi membutuhkan campuran pelarut. Hal tersebut dimungkinkan karena kelarutan senyawa tersebut lebih baik ketika dilarutkan dengan kombinasi pelarut dibandingkan hanya dengan pelarut tunggal (Tan, Reed, Gahm, King, Seran, Bostick, et al., 2008). Apabila menggunakan campuran dua macam pelarut, syarat

utamanya adalah kedua campuran pelarut tersebut harus mampu bercampur secara homogen (Zala, et al., 2012).

C.Kromatografi 1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan cara sederhana pada identifikasi pendahuluan suatu senyawa. Metode ini juga bermanfaat pada pemisahan suatu senyawa berdasarkan perbedaan distribusi dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Data yang diperoleh dari metode ini berupa harga

Retardation factor (Rf) dan warna bercak kromatogram yang diperoleh dari pengembangan bercak pada plat kromatografi lapis tipis (Rohyami, 2008). Nilai Rf digunakan untuk menunjukkan posisi hasil pemisahan suatu senyawa secara spesifik, yang dihitung dengan cara:

Rf (retardation factor) =

(Sherma dan Fried, 2003). Kromatografi lapis tipis merupakan teknik kromatografi yang paling sering digunakan untuk uji kualitatif senyawa – senyawa organik, isolasi senyawa tunggal dari senyawa campuran, uji kuantitatif, dan sebagai isolasi preparatif. Pada beberapa kasus tertentu, terkadang kromatografi lapis tipis digabungkan dengan teknik kromatografi lainnya. Tersedia berbagai macam fase diam yang dilapisi pada KLT maupun pada High Performance Thin Layer Chromatography

(HPTLC), yaitu: fase diam anorganik (silika atau silika gel dan alumina), fase diam organik (polyamide, selulosa), fase diam organik polar yang terikat secara kovalen dengan modifikasi pada matriks silika gel (diol, sianopropil, dan

aminopropil), dan fase diam organik bersifat nonpolar (RP2, RP8, RP18) yang memiliki kerapatan yang berbeda – beda. Selain itu, terdapat berbagai macam pilihan fase gerak yang dapat digunakan untuk memisahkan campuran senyawa yang bergantung pada selektivitas senyawa bedasarkan donor proton, penerima proton, dan gaya dipol. Penyerapan sinar UV pada KLT, fase gerak tidak memberikan pengaruh yang signifikan untuk deteksi senyawa dan untuk uji kuantitatif. Hal tersebut dikarenakan fase gerak pada KLT akan menguap terlebih dahulu sebelum dideteksi (Hajnos, Sherma, dan Kowalska, 2008).

Kelebihan dari metode KLT ini adalah metode preparasi yang paling sederhana apabila dibandingkan dengan Gas Chromatography (GC) dan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Selain itu, beberapa macam sampel dapat dianalisis pada satu – satuan waktu hanya dengan satu lempengKLT atau lempeng HPTLC, sehingga dapat mempersingkat waktu dan juga meminimalisir volume pelarut yang digunakan untuk tiap sampel. Baik larutan standart maupun sampel juga dapat diletakkan pada satu lempeng yang sama sehingga dapat memberikan akurasi dan presisi pada uji kuantitatif dengan densitometer (Hajnos, et al., 2008). Pada teknik pemisahan dengan KLT, jumlah sampel yang dibutuhkan lebih sedikit, fleksibel dalam pemilihan deteksi sampel, memiliki jumlah kapasitas massa yang tinggi, mudah dilakukan, biaya yang dikeluarkan lebih murah, dan tidak membutuhkan fasilitas laboratorium yang modern (Sherma dan Fried, 2003).

Kekurangan dari metode KLT ini adalah tidak dapat menggunakan pelarut yang memiliki viskositas yang tinggi (Hajnos, et al., 2008). Metode KLT

juga memiliki efisiensi pemisahan yang rendah dan reprodusibilitas nilai Rf dipengaruhi oleh kondisi lingkungan apabila dibandingkan dengan HPLC dan GC (Sherma dan Fried, 2003).

Setelah melakukan optimasi pemisahan dengan fase gerak dan pengembangan teknik kombinasi, zona bercak perlu dilakukan deteksi lebih lanjut. Hal tersebut dilakukan apabila bercak tidak berwarna ataupun tidak berflorosensi, ataupun juga tidak menyerap lampu UV pada panjang gelombang 254 nm, maka bercak tersebut dapat dilihat melalui peredaman fluorosensi dengan F-plates khusus yang mengandung indikator fluorosensi, atau bisa juga melalui reagen deteksi dengan cara disemprot atau dicelup yang biasanya dapat diikuti dengan pemanasan. Identifikasi golongan senyawa dari analit dapat menggunakan reagen yang bersifat selektif. Salah satu contoh reagen yang digunakan adalah reagen Dragendorff (KbiI4) yang digunakan untuk identifikasi adanya basa heterosiklik (seperti alkaloid) (Hajnos, et al., 2008).

2. Kromatografi kolom

Kromatografi kolom merupakan salah satu teknik kromatografi yang paling sering digunakan karena mudah dalam pengoperasiannya. Kolom pada kromatografi ini diisi dengan fase diam. Fase diam yang sering digunakan yaitu silika dan alumina. Sampel yang akan dipisahkan secara kromatografi, sebelumnya dicampur terlebih dahulu dengan fase diam dan kemudian dimasukkan pada kolom kromatografi tersebut. Prinsip pemisahan pada kromatografi kolom adalah fase gerak akan bergerak turun secara kapiler melewati kolom tersebut hingga mencapai dasar kolom membawa analit yang

terlarut. Kelebihan lain yang dimiliki kromatografi kolom ini adalah hanya membutuhkan pelarut dalam jumlah yang sedikit. Kromatografi kolom merupakan variasi dari preparasi sampel secara KLT karena fase diam yang digunakan dapat sama dengan fase diam yang digunakan pada KLT (Hostettmann, Marston, Hostettmann, 1997).

Kromatografi kolom merupakan salah satu jenis kromatografi adsorpsi yang sering digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa organik. Hal tersebut dikarenakan senyawa organik memiliki kelarutan yang rendah dengan pelarut air atau campuran antara pelarut organik dan air sehingga hasil pemisahan senyawa akan lebih baik apabila dibandingkan dengan kromagrafi cair fase terbalik (Hurtubise, 2010).

Metode step – gradient chromatography adalah suatu metode elusi pada kromatografi dengan perubahan fase gerak yang satu dengan fase gerak lainnya secara bertahap. Prinsip utama dengan adanya perubahan gradien pada fase gerak adalah untuk meningkatkan kekuatan elusi dari fase gerak, sehingga salah satu senyawa dari analit akan bercampur dengan fase gerak yang sesuai (Wu, Liang, dan Berthod, 2012).

D. Antioksidan 1. Reactive Oxygen Species (ROS)

Oksigen yang dihirup dalam proses pernapasan berperan dalam reaksi intermediet yang disebut sebagai reactive oxygen species (ROS). Reactive oxygen species (ROS) yang berlebih dalam tubuh ini dapat merusak protein, lemak, dan DNA, yang mengakibatkan stress oksidatif, yaitu ketidakseimbangan antara

oksidan dan antioksidan dalam proses oksidasi, hal ini diduga sebagai penyebab penuaan dini dan berbagai macam penyakit pada manusia (Choi, 2009).

Reactive oxygen species pada kondisi fisiologis normal akan tersimpan pada organel sel spesifik, yang kemudian akan dimusnahkan oleh sel fagositosis. Reaksi reduksi dari molekul oksigen (O2) menjadi air (H2O) adalah dengan melalui transfer elektron tunggal, oleh karena itu, akan terjadi reaksi intermediet seperti superoksida anion (O2-), hidrogen peroksida (H2O2), dan hidroksiradikal (HO•) yang akan tersimpan dalam mitokondria. Beberapa enzim sitokrom P – 450 juga dapat mereduksi O2 menjadi O2- secara langsung. Sehingga diperlukannya suatu mekanisme perlindungan terhadap ROS (Tringali, 2001).

2. Senyawa dan golongan senyawa antioksidan

Antioksidan adalah suatu senyawa yang dapat menghambat proses oksidasi dengan cara menghambat polimerisasi rantai yang diawali dengan adanya radikal bebas yang kemudian dilanjutkan dengan reaksi oksidasi (Cespedes, Morales, Avila, Hafidi, Alarcon, dan Lopez, 2009). Mekanisme perlindungan ROS enzimatik yaitu superoxide dismute (SOD) yang mengkatalisis O2- menjadi O2 dan H2O2. H2O2 ini kemudian dimetabolisme kembali menjadi O2 dan H2O. Selain itu, juga diperlukan antioksidan non – enzimatik seperti vitamin E untuk membantu meminimalisir konsentrasi HO• yang ada pada membran sel. Sebuah titik kritis terjadi ketika pengumpulan dan detoksifikasi ROS dalam sel, dimana dengan adanya penyakit, usia, senyawa – senyawa kimia seperti obat, pestisida, herbasida, serta berbagai macam polutan dapat merusak mekanisme perlindungan tubuh terhadap radikal bebas (Tringali, 2001).

Antioksidan sintetis yang telah lama digunakan yaitu butylated hydroxy toluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA), propylgallate, dan tert – butyl hydroquinone, akan tetapi penggunaan BHA dan BHT ini diduga dapat menginduksi kerusakan hati dan bersifat karsinogenik, sehingga diperlukan sumber antioksidan lain yang dapat berasal dari bahan alam yang lebih aman untuk dikonsumsi (Choi, 2009). Antioksidan alami yang terdapat pada tumbuhan yaitu seperti α – tocopherol, asam askorbat, karotenoid, flavonoid, dan senyawa – senyawa fenolik. Vitamin E (α – tocopherol), merupakan antioksidan alami yang efektif akan tetapi penggunaannya terbatas. Sehingga, industri makanan dan pengobatan mengembangkan antioksidan alami yang berasal dari tumbuh – tumbuhan (Tringali, 2001).

Curcuma longa memiliki pigmen kekuningan yang merupakan senyawa golongan fenolik yang memiliki peran sebagai penangkap radikal bebas, dimana senyawa golongan tersebut menurut Pundir dan Jain (2010) larut dalam etanol. Flavonoid dan tanin merupakan senyawa yang berfungsi sebagai penangkap radikal bebas karena ketiga senyawa tersebut adalah senyawa fenol yaitu senyawa dengan gugus –OH yang terikat pada cincin aromatik, sehingga juga terlarut dalam etanol (Kuntorini, Astuti, dan Miliana, 2011). Ekstrak etanolik rimpang kunyit mengandung golongan senyawa saponin, terpenoid, dan flavonoid (Chhetri, et al., 2008). Senyawa – senyawa golongan fenolik memiliki satu atau lebih cincin aromatis dengan satu atau lebih gugus hidroksil tersebut berpotensi menangkap senyawa – senyawa radikal bebas dengan membentuk resonansi radikal fenoksil stabil dan juga dengan reaksi reduksi oksidasi (Choi, 2009).

3. Metode 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

Metode radikal bebas 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) merupakan uji antioksidan yang stabil dalam suhu ruang dan dapat berkurang dengan adanya molekul antioksidan yang ditandai dengan perubahan warna dari violet menjadi tidak berwarna dalam larutan etanol (Garcia, Oldoni, Alencar, Reis, Loguercio, dan Grande, 2012).

Metode DPPH merupakan metode yang sederhana, cepat, dan mudah untuk skrining aktivitas penangkap radikal beberapa senyawa, selain itu metode ini terbukti akurat dan praktis (Rastuti, 2012). Hasil yang didapatkan dengan metode ini bersifat reprodusibel dan sebanding dengan metode penangkap radikal bebas lainnya (Kedare dan Singh, 2011).

Kekurangan dari metode DPPH ini adalah DPPH memiliki halangan sterik yang cukup besar, sehingga molekul yang kecil lebih memungkinkan untuk bereaksi dengan DPPH dibandingkan dengan molekul yang besar (Bergeron, Carrier, dan Ramaswamy, 2012). Selain itu, DPPH hanya dapat larut pada pelarut organik dan tidak dapat mengukur aktivitas antioksidan dalam plasma karena protein dalam plasma akan terpresipitasi pada pelarut alkohol (Kedare dan Singh, 2011). Senyawa DPPH memiliki radikal bebas yang terdelokalisasi pada molekulnya, sehingga memberikan warna ungu (Kedare dan Singh, 2011).

Metode DPPH juga dapat dikembangkan dengan KLT dimana lempeng KLT yang telah mengandung senyawa sampel tersebut dan telah dielusi, dicelup atau disemprot dengan larutan DPPH yang telah diketahui konsentrasinya. Metode ini bertujuan sebagai langkah awal untuk mengetahui adanya sampel yang mengandung antioksidan (Komsta, Hajnos, dan Sherma, 2014). Menurut Ngan (cit., Marliana, 2007) zona bercak yang berubah warna menjadi keputih – putihan, kekuning – kuningan, atau kuning pada sinar tampak setelah disemprot dengan DPPH diidentifikasi sebagai antioksidan.

E.Antibakteri 1. Bakteri

Bakteri merupakan organisme (bentuk unsur terkecil yang sudah memiliki kehidupan) bersel tunggal yang mudah ditemui di dalam tubuh ataupun di luar tubuh (kecuali cairan darah dan cairan tulang belakang) (Utami, 2012). Bakteri secara global dibagi dalam dua kelompok besar setelah diwarnai menurut metode sarjana Denmark dr. Gram, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Tjay dan Rahardja, 2007).

Infeksi pada kulit, seringkali disebabkan oleh jamur, Staphylococcus aureus, dan Streptococcus sp (Kareru, et al.,2010). Staphylococcus aureus

merupakan bakteri Gram positif yang dapat menyebabkan berbagai macam infeksi pada manusia seperti menyebabkan lesi pada kulit, sedangkan infeksi serius dari bakteri ini dapat menyebabkan pneumonia, meningitis, infeksi saluran kemih. Selain itu, bakteri ini juga dapat menyebabkan keracunan makanan karena melepaskan enterotoxin ke dalam makanan dan menyebabkan shock sindrom

dengan adanya pelepasan superantigens pada aliran darah. Escherichia coli

merupakan bakteri Gram negatif yang umumnya ada pada saluran pencernaan manusia, tetapi kadang – kadang bakteri ini juga dapat menyebabkan infeksi pada manusia (Lodhia, Bhatt, dan Thaker, 2009).

2. Mekanisme antibakteri

Antibakteri berdasarkan mekanisme kerjanya dibagi menjadi dua macam, yaitu: antibakteri bersifat bakterisidal dan bersifat bakteriostatik. Dikatakan bakterisidal karena antibakteri tersebut pada dosis biasa berkhasiat mematikan bakteri, sedangkan bersifat bakteriostatik karena antibakteri tersebut pada dosis biasa mampu menghambat pertumbuhan atau perkembangbiakan suatu bakteri dimana pemusnahannya dilanjutkan dengan sistem pertahanan tubuh sendiri

dengan cara fagositosis (‘dimakan’ oleh limfosit) (Tjay dan Rahardja, 2007). Prinsip terapi secara umum dengan antibakteri yaitu: suatu antibakteri seharusnya membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri tanpa membahayakan tubuh manusia sebagai inangnya, dan obat terpenetrasi ke jaringan tubuh yang dituju, serta menuju ke bakteri target secara spesifik. Intinya, antibakteri bersifat efektif atau poten dengan efek samping yang rendah, atau memiliki toksisitas selektif terhadap bakteri patogen yang dituju (Nugroho, 2012).

3. Resistensi bakteri

Resistensi merupakan kemampuan alami bakteri untuk tidak terpengaruh terhadap agen antibakteri (Nugroho, 2012). Salah satu penyebab terjadinya resistensi ini adalah penggunaan antibakteri yang tidak rasional. Oleh sebab itu, dikembangkan penemuan senyawa baru sebagai antibakteri yang salah satu

sumbernya berasal dari tanaman. Berbagai macam bagian tanaman telah digunakan untuk perawatan kulit sebagai antibakteri dan antifungi seperti daun, ranting, akar, kulit batang, ataupun buah yang diaplikasikan secara topikal. Sediaan dalam bentuk gel, krim, dan sabun yang mengandung berbagai macam ekstrak tanaman telah digunakan untuk mengobati berbagai macam penyakit pada

kulit yang disebabkan oleh infeksi mikroba (Kareru, Keriko, Kenji, Thiong’o,

Gachanja, dan Mukiira, 2010).

4. Golongan senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri

Telah dilaporkan bahwa berbagai macam ekstrak rimpang kunyit dapat menimbulkan efek antibakteri pada bakteri patogen baik pada bakteri Gram negatif maupun bakteri Gram positif. Efek yang diberikan kunyit pada bakteri Gram positif yaitu, S. aureus dan Staphylococcus epidermidis. Efek yang diberikan kunyit pada bakteri Gram negatif yaitu E. coli, Pseudomonas aeruginosa, dan Salmonella typhimurium (Singh, Chandra, Bose, dan Luthra, 2002).

Rimpang kunyit dapat menghambat pertumbuhan jamur, virus, dan bakteri karena mengandung berbagai senyawa diantaranya adalah kurkumin dan minyak atsiri. Senyawa sesquiterpen dalam minyak atsiri kunyit merupakan turunan dari senyawa terpen seperti alkohol yang bersifat bakterisida (Warnaini, 2013).

5. Uji kualitatif antibakteri dengan metode bioautografi kontak

Bioautografi merupakan metode skrinning mikrobiologi yang pada umumnya digunakan sebagai uji pendahuluan dalam rangka untuk mengetahui

ada tidaknya aktivitas antibakteri pada analit. Kelebihan dari metode ini adalah sensitif, sederhana, murah, tidak membuang waktu, dan tidak membutuhkan peralatan dengan teknologi yang tinggi. Metode bioautografi yang akan digunakan adalah bioautografi yang dikombinasikan dengan teknik Kromatografi Lapis Tipis (KLT), sehingga sering juga disebut sebagai bioautografi kontak. Prosedur pada metode bioautografi sama seperti prosedur yang digunakan pada metode difusi agar. Perbedaannya adalah senyawa uji akan berdifusi ke media agar dari lempeng KLT. Hal tersebut dilakukan dengan cara lempeng KLT atau kromatografi kertas yang telah berisi senyawa uji diletakkan pada medium agar yang telah diinokulasikan bakteri atau jamur tersebut selama beberapa menit atau jam supaya mengalami difusi. Selanjutnya, lempeng tersebut diambil dan lapisan agar diinkubasi. Maka akan muncul zona hambat dimana senyawa antimikroba tersebut telah kontak dengan medium agar (Choma, dan Grzelak, 2010).

Bioautografi merupakan metode yang efektif untuk mendeteksi adanya senyawa antibakteri pada senyawa – senyawa kompleks, hal tersebut dikarenakan metode ini memfasilitasi senyawa yang memiliki aktivitas antibakteri terlokalisasi secara langsung dari lempeng KLT yang kontak dengan mikroorganisme. Sehingga metode ini cocok untuk penemuan senyawa antibakteri baru yang berasal dari tumbuh – tumbuhan ataupun dari senyawa alam lainnya. Bioautografi dapat digunakan sebagai awalan untuk tahap isolasi selanjutnya, sehingga tidak membuang waktu untuk mengisolasi senyawa yang tidak memiliki aktivitas antibakteri karena dapat mengetahui lokasi senyawa yang memiliki aktivitas (Suleiman, McGaw, Naidoo, dan Eloff, 2010).

6. Uji daya antibakteri dengan metode Kirby – Bauer

Metode Kirby – Bauer disc diffusion merupakan metode yang paling sering digunakan untuk menguji daya antibakteri dengan menggunakan paper disc

yang mengandung berbagai macam senyawa aktif dengan volume yang diketahui.

Paper disc yang telah berisi senyawa aktif tersebut kemudian diinokulasikan pada media agar yang telah mengandung bakteri uji (Vasanthakumari, 2009). Media agar yang digunakan pada metode ini adalah Mueller – Hinton agar (Gillespie, 1994). Daya antibakteri ditentukan dengan adanya zona hambat yang terbentuk di sekitar disc yang mengandung senyawa aktif. Hal tersebut dapat terjadi karena senyawa aktif akan berdifusi dari disc ke medium untuk menghambat pertumbuhan bakteri uji di sekitar daerah paper disc (Vasanthakumari, 2009).

Ukuran zona hambat dapat dipengaruhi oleh kepadatan atau viskositas media biakan, kecepatan difusi antibiotik, konsentrasi antibiotik pada paper disc, sensitivitas organisme terhadap antibiotik, dan interaksi antibiotik dengan media. Selain itu, suatu zat yang ditemukan mempunyai efek signifikan tidak boleh digunakan untuk terapi secara langsung karena dimungkinkan zat tersebut memiliki efek samping signifikan pada sistem yang diobati (Harmita, Radji, 2006).

Kelebihan metode ini adalah metode ini relatif mudah dilakukan karena tidak memerlukan peralatan khusus, relatif murah, dan juga bersifat fleksibel dalam pemilihan disc yang akan digunakan untuk uji. Kelemahan dari metode ini adalah tidak dapat digunakan secara akurat untuk bakteri yang pertumbuhannya lambat (Jorgensen dan Ferraro, 2009).

F. UV Protection 1. Radiasi ultraviolet pada kulit

Kulit merupakan organ terluar dan terbesar yang paling rentan terhadap bahaya sinar matahari karena kulit terpapar secara langsung oleh sinar matahari. Ketika kulit mamalia terpapar radiasi ultraviolet dalam waktu yang lama, akan menginduksi oksidatif stress dengan adanya spesies oksigen reaktif yang dapat menyebabkan kanker kulit pada seseorang. Selain itu, paparan sinar ultraviolet juga dapat mengakibatkan yaitu edema, eritema, pembentukan sel – sel yang terbakar, hiperplasia, immunosupresi, kerusakan DNA, penuaan dini, dan melanogenesis. Salah satu mekanisme tubuh untuk melindungi sel – sel kulit dari paparan sinar ultraviolet yaitu dengan adanya pigmen melanin yang dapat menyerap sinar ultraviolet. Jumlah melanin yang terbentuk tersebut pada kondisi tertentu terkadang tidak cukup untuk melindungi kulit dari paparan sinar ultraviolet, sehingga diperlukan sebuah strategi untuk melindungi kulit dari radiasi sinar ultraviolet dengan menggunakan tabir surya untuk menetralkan spesies oksigen reaktif dengan cara mengeblok paparan radiasi ultraviolet pada epidermis (Balakrishnan, et al., 2011).

2. Tabir surya

Tabir surya pada umumnya dikembangkan untuk meminimalisir eritema, merupakan suatu senyawa kimia yang mampu menyerap dan mengurangi efek radiasi sinar ultraviolet terhadap sel - sel kulit (Sarkar, 2012). Tabir surya memiliki beranekaragam komposisi dan mekanisme aksi seperti mengeblok, memantulkan, maupun menghamburkan radiasi sinar ultraviolet (Latha, Martis,

Shobha, Shinde, Bangera, Krishnankutty, et al., 2013). Tabir surya secara garis besar dibedakan menjadi dua macam yaitu kimia dan fisika. Tabir surya secara kimia mengandung senyawa aromatis yang terkonjugasi dengan gugus karbonil. Senyawa utama yang berperan penting sebagai fotoprotektif yaitu asam fenolik, flavonoid, dan polifenol. Struktur ini akan menyerap energi tinggi dari sinar ultraviolet dan kemudian melepaskan energi tersebut sebagai energi yang rendah (Balakrishnan, et al., 2011). Tabir surya secara fisika seperti titanium dioksida dan zinc oxide, bekerja dengan cara membentuk lapisan pada kulit yang mampu memantulkan, menghamburkan sinar ataupun mengeblok paparan sinar ultraviolet (Zhai, Wilhelm, dan Maibach, 2008).

3. Uji aktivitas tabir surya dengan metode inhibition of bleaching of -carotene

Senyawa -carotene merupakan salah satu bentuk sederhana dari karotenoid, yang memiliki rumus molekul C40H56. Senyawa -carotene sangat tidak stabil dalam udara karena dapat teroksidasi dan juga tidak stabil terhadap cahaya dan panas sebab dapat mengalami isomerisasi menjadi bentuk cis

-carotene yang lebih tidak stabil (Tungriani, Karim, dan Seniwati, 2012).

Senyawa -carotene larut dalam benzena, kloroform, karbon disulfida; cukup larut dalam eter, petroleum eter, minyak; tidak larut pada air, asam, basa

(O’Neil, 2001). Struktur -carotene, yaitu:

Prinsip metode inhibition of bleaching of -carotene adalah berdasarkan pemudaran warna larutan -carotene dari warna kuning. Pemudaran warna ini akan terjadi apabila tidak adanya senyawa antioksidan. Hal tersebut dikarenakan adanya senyawa antioksidan yang mampu membantu mempertahankan ikatan konjugasi µ dari -carotene (Ueno, Yamakura, Arastoo, Oshima, dan Kokubo, 2014).

G. Landasan Teori

Manfaat antioksidan yaitu dapat menangkap radikal bebas yang dapat membahayakan tubuh, sedangkan tabir surya digunakan untuk melindungi tubuh dari radiasi sinar ultraviolet (UV). Antibakteri yang terdapat dalam kosmetik dapat berfungsi sebagai pencegah pertumbuhan bakteri baik untuk sediaan kosmetik itu sendiri maupun untuk mencegah timbulnya jerawat pada kulit yang disebabkan oleh bakteri.

Rimpang kunyit mengandung kurkumin yang merupakan senyawa golongan fenolik yang dapat larut dalam etanol. Selain itu, ekstrak etanolik rimpang kunyit juga mengandung golongan senyawa saponin, terpenoid, dan flavonoid. Flavonoid merupakan senyawa antioksidan karena senyawa tersebut adalah senyawa fenol yang berpotensi menangkap senyawa – senyawa radikal bebas dengan membentuk resonansi radikal fenoksil stabil dan juga dengan reaksi reduksi oksidasi. Oleh sebab itu, rimpang kunyit tidak hanya berpotensi sebagai antioksidan tetapi juga sebagai tabir surya karena golongan senyawa utama yang berperan sebagai fotoprotektif yaitu fenolik karena adanya cincin aromatis yang terkonjugasi dengan gugus karbonil.

Rimpang kunyit dapat menghambat pertumbuhan bakteri karena mengandung golongan senyawa fenolik dan senyawa sesquiterpen dalam minyak atsiri yang merupakan turunan senyawa terpen. Minyak atsiri ini juga terdapat dalam ekstrak etanolik kunyit.

Oleh sebab itu, dilakukan uji aktivitas pendahuluan rimpang kunyit sebagai penangkap radikal bebas dengan metode DPPH, sebagai antibakteri dengan metode bioautografi kontak, dan sebagai UV ptotection dengan menggunakan metode inhibition of bleaching of -carotene untuk mengetahui zona bercak yang aktif. Setelah itu, dilanjutkan dengan isolasi senyawa dengan kromatografi kolom dan dilakukan uji aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection pada isolat tersebut.

H. Hipotesis

Hasil isolasi yang didapatkan dari ekstrak rimpang kunyit memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection.

28 BAB III

METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksploratif.

B. Definisi Operasional

1. Ekstrak kental rimpang kunyit merupakan ekstrak etanolik rimpang kunyit yang telah dipekatkan dengan menggunakan evaporator.

2. Isolat merupakan hasil isolasi dengan kromatografi kolom dari zona bercak ekstrak rimpang kunyit yang memiliki aktivitas.

C. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian

Rimpang kunyit dalam bentuk simplisia kering sebanyak 1 kg diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah. Bahan kimia kualitas pro analitik Sigma Chem. Co., USA meliputi DPPH dan

-carotene. Bahan kimia kualitas pro analitik Merck, Germany meliputi etanol, n-heksan, kloroform, metanol, NaCl, lempeng KLT silika gel 60 F254 dan silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm). Akuades diperoleh dari Brataco Chemica. Mueller – Hinton agar, kultur murni S. aureus ATCC 25923 dan kultur murni E. coli ATCC 25922 diperoleh dari Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta. Media Agar No. 1 diperoleh dari Oxoid dan Trypticasein Soy Broth (TSB) diperoleh dari Agarindo

Biological Company. Amoksisilin sebagai kontrol positif didapatkan dari Indofarma.

2. Alat penelitian

Alat – alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa blender, seperangkat alat maserasi, vacuum rotary evaporator (Buchi), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), oven (WTB binder), penjepit, micro haematocrit tubes, light meter (Lutron), lampu UV 254 nm, lampu UV 366 nm, mikropipet 100 – 1000 µL; 5 – 50 µL; 0,5 – 10 µL (Acura 825, Socorex), sentrifuge, vortex

(Junke & Kunkel), penangas air (labo – tech, Heraceus), autoclave (YX – 400Z), inkubator, ose, tabung reaksi bertutup, dan alat – alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex – Germany dan Iwaki).

D. Tatacara Penelitian 1. Pengumpulan dan penyiapan bahan

a. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman pada rimpang kunyit diperlukan untuk mengetahui kebenaran bahan rimpang kunyit yang digunakan pada penelitian.

b. Pengumpulan bahan

Satu kilogram rimpang kunyit kering diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah.

c. Penyiapan bahan

Simplisia rimpang kunyit yang telah diperoleh tersebut diserbuk dengan menggunakan blender.

d. Susut pengeringan simplisia

Cawan petri yang telah dikeringkan sebanyak 3 buah ditimbang dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 105 hingga mencapai bobot tetap. Setelah ketiga cawan petri tersebut mencapai bobot tetap, ditambahkan serbuk simplisia rimpang kunyit dan ditimbang cawan petri beserta serbuk simplisia tersebut hingga didapatkan serbuk simplisia ± 0,5 gram pada masing – masing cawan. Ketiga cawan petri tersebut kemudian dimasukkan ke dalam oven pada suhu 50 hingga mencapai bobot tetap.

2. Ekstraksi

a. Pembuatan ekstrak kental rimpang kunyit

Satu kilogram simplisia kering dalam bentuk serbuk tersebut ditimbang dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi serta ditambahkan dengan etanol 90% v/v hingga dapat merendam seluruh serbuk simplisia tersebut. Campuran tersebut kemudian dimaserasi selama 24 jam pada suhu ruang. Setelah 24 jam, campuran disaring sehingga didapatkan filtrat pertama dan residu yang tersisa dilakukan maserasi kembali dengan menggunakan pelarut etanol 90% v/v selama 24 jam pada suhu ruang. Filtrat kedua diperoleh melalui penyaringan dari hasil maserasi kedua. Filtrat pertama dan kedua kemudian dicampurkan hingga

homogen dan dilakukan evaporasi hingga menjadi ekstrak kental. Ekstrak kental ini kemudian disimpan dalam lemari pendingin.

b. Susut pengeringan ekstrak

Cawan petri yang telah dikeringkan sebanyak 3 buah ditimbang dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 105 hingga mencapai bobot tetap. Setelah ketiga cawan petri tersebut mencapai bobot tetap, ditambahkan ekstrak kental dan ditimbang cawan petri beserta ekstrak kental tersebut hingga didapatkan ekstrak kental ± 0,5 gram pada masing

– masing cawan. Masing – masing cawan tersebut ditambahkan silika ± 0,5 gram. Ketiga cawan petri tersebut kemudian dimasukkan ke dalam oven pada suhu 50 hingga mencapai bobot tetap.

3. Optimasi fase gerak pada ekstrak kental rimpang kunyit a. Preparasi sampel dari ekstrak kental

Sebanyak 5 mg ekstrak kental yang telah diperoleh ditimbang dan dilarutkan ke dalam 1 mL etanol. Campuran tersebut kemudian diaduk hingga homogen.

b. Optimasi fase gerak pada ekstrak kental

Sampel yang telah didapatkan kemudian ditotolkan sebanyak 5 spot pada lempeng KLT dengan jarak elusi 5 cm, dimana masing – masing fase gerak mendapatkan 1 spot yang kemudian dibandingkan dan diamati kelima hasil elusi tersebut. Macam – macam fase gerak yang digunakan, yaitu:

b) Kloroform : metanol (7:3 v/v) c) Kloroform : metanol (9:1 v/v) d) Kloroform : metanol (95:5 v/v)

e) Etil asetat: asam formiat: asam asetat glasial: air (100:11:11:20 v/v)

4. Identifikasi golongan senyawa pada ekstrak kental rimpang kunyit a. Deteksi secara fisik

Ekstrak kental yang telah disiapkan tersebut ditotolkan pada lempeng KLT dengan jarak elusi 5 cm dan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Lempeng KLT hasil elusi kemudian dikeringkan pada suhu ruang. Setelah kering, lempeng KLT tersebut dideteksi pada lampu UV 254 nm dan 366 nm.

b. Identifikasi golongan senyawa dengan reagen semprot

Ekstrak kental tersebut diidentifikasi golongan senyawanya dengan menggunakan KLT dengan jarak elusi 5 cm. Hasil elusi yang telah dikeringkan tersebut kemudian divisualisasi dengan pereaksi AlCl3, FeCl3, sitroborat, Dragendorff, dan vanilin sulfat. Hasil KLT tersebut kemudian diamati dan dihitung nilai Rf yang timbul pada masing – masing pereaksi tersebut.

5. Uji kualitatif penangkap radikal bebas ekstrak rimpang kunyit a. Preparasi pereaksi semprot DPPH

Pereaksi DPPH dibuat 0,2% b/v dalam pelarut metanol dan disimpan dalam wadah gelap dan tertutup rapat (Marston, 2011).

b. Uji kualitatif penangkap radikal bebas DPPH

Ekstrak kental 5 mg/ mL dalam etanol ditotolkan pada lempeng KLT dengan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan jarak elusi 5 cm. Lempeng KLT hasil elusi tersebut kemudian dikeringkan pada suhu ruang dan selanjutnya disemprot dengan pereaksi DPPH. Hasil positif ditandai dengan adanya bercak berwarna kuning – putih dengan latar ungu pada lempeng KLT.

6. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak rimpang kunyit a. Pembuatan larutan Mac Farland 0,5 (1,5 x 108 CFU/mL)

Larutan barium klorida 1,175% b/v diambil sebanyak 0,05 mL lalu ditambahkan 9,95 mL larutan asam sulfat 1% b/v, diaduk hingga homogen (Mahon, Lehman, Manuselis, 2011).

b. Pembuatan media 1) Media TSB cair

Tiga gram media TSB (30 g/ L) dilarutkan dalam 100 mL

aquadest diaduk hingga homogen di atas penangas air. Media tersebut disterilkan dengan autoclave. Setelah itu, media TSB tersebut dituang ke dalam tabung dengan volume masing – masing tabung 20 mL secara aseptis.

2) Media agar

Enam gram media TSB (30 g/L) ditambahkan 1,2% b/v agar dan dilarutkan dalam 200 mL aquadest. Campuran tersebut diaduk hingga homogen di atas penangas air dan disterilkan dengan

autoclave. Kemudian, campuran tersebut dituang ke dalam cawan petri dengan volume masing – masing cawan petri 15 mL secara aseptis dan dibiarkan hingga memadat.

c. Pembuatan saline water 0,9% b/v

Natrium klorida ditimbang 0,9 gram yang kemudian dilarutkan dalam 100 mL aquadest hingga larut.

d. Pembuatan suspensi bakteri uji

Kultur murni bakteri uji E. coli dan S. aureus masing – masing diambil sebanyak 1 ose dan masing – masing diinokulasikan pada media TSB cair, kemudian diinkubasi selama 24 jam. Pembuatan suspensi bakteri uji dilakukan dengan cara bakteri dari media TSB cair yang telah diinkubasi tersebut ditambahkan ke dalam 10 mL saline water hingga kekeruhannya sesuai dengan larutan standar Mac Farland 0,5 (1,6 x 108 CFU/mL).

e. Penyimpanan kultur bakteri

Sisa kultur bakteri yang belum diuji dari media TSB cair yang telah diinkubasi tersebut, masing – masing diambil 0,5 mL dan dicampur dengan 25 µL gliserol dalam wadah tabung eppendorf yang berbeda. Tabung eppendorf tersebut kemudian diinkubasi selama 1 jam dalam inkubator dengan suhu 37 dan kemudian disimpan dalam freezer.

f. Pembuatan kontrol

1) Kontrol kontaminasi media

Kontrol kontaminasi media dibuat dengan cara menuang 15 mL media agar pada cawan petri secara aseptis yang kemudian diinkubasi selama 24 jam dan kemudian diamati.

2) Kontrol pertumbuhan bakteri uji

Kontrol pertumbuhan bakteri uji dibuat dengan cara menginokulasikan 100 µ L bakteri uji dan diratakan dengan cotton bud dalam media agar yang telah dibuat sebelumnya, diinkubasi selama 24 jam dan kemudian diamati.

3) Kontrol positif

Kontrol positif dibuat dengan menggunakan amoksisilin dengan konsentrasi 5 mg/ mL dan diambil 15 µL, 20 µL, dan 30 µL yang kemudian masing – masing ditotolkan pada paper disc yang berbeda – beda. Paper disc tersebut kemudian diletakkan pada media agar yang telah diinokulasikan 100 µL bakteri uji, diinkubasi selama 24 jam dan diamati.

g. Penyiapan sampel

Ekstrak kental rimpang kunyit ditimbang 5 mg dan dilarutkan dalam 1 mL etanol yang kemudian ditotolkan pada lempengKLT dengan volume 15 µL, 20 µL, dan 30 µL sehingga akan didapatkan mass loading

75 µg, 100 µg, dan 150 µg. Lempeng KLT tersebut kemudian dielusi dengan jarak elusi 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol

(95 : 5 v/v). Setelah dielusi, lempeng KLT tersebut dibiarkan mengering secara aseptis.

h. Metode bioautografi kontak

Lempeng KLT yang telah kering tersebut, dikontakkan pada media agar yang telah diinokulasikan 100 µL bakteri uji secara

spreading. Setelah 40 menit, lempeng KLT tersebut diangkat dari media agar dan media agar tersebut diinkubasi selama 18 jam yang kemudian diamati lokasi bercak yang mengandung daya antibakteri. Daya antibakteri ditunjukkan dengan adanya zona hambat pada media agar tersebut (Choma, dan Grzelak, 2010).

7. Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak rimpang kunyit a. Preparasi pereaksi -carotene

Pereaksi -carotene dibuat 0,05% b/v dalam pelarut kloroform dan disimpan dalam wadah gelap dan tertutup rapat (Marston, 2011). b. Optimasi intensitas cahaya

Lempeng KLT kosong dicelupkan dalam pereaksi -carotene

yang telah dibuat sebelumnya dan warna lempeng KLT tersebut diukur dengan menggunakan indikator warna. Lempeng KLT kemudian disinari dengan lampu UV dalam kotak fluoroscent, dimana posisi ketinggian lampu UV diatur yaitu 100 cm dari dasar, 50 cm dari dasar, dan 35 cm dari dasar serta intensitas cahaya pada tiap ketinggian diukur dengan alat

light meter. Perubahan warna yang terjadi pada latar lempeng KLT tersebut diamati pada menit ke – 0, 1, 3, 6, 9, 12, dan 15. Tiap posisi

lampu tersebut dilakukan dengan 5 kali replikasi dan dihitung standar deviasi serta rata – rata perubahan warnanya.

c. Uji kualitatif aktivitas -carotene

Larutan ekstrak dengan konsentrasi 5 mg/ mL yang telah disiapkan ditotolkan pada lempeng KLT untuk dielusi dengan jarak elusi 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Lempeng KLT yang telah dielusi kemudian dicelupkan dengan pereaksi -carotene

dan warna pada lempeng KLT tersebut diukur dengan menggunakan indikator warna. Setelah itu, lempeng KLT tersebut disinari dengan sinar UV dalam kotak fluoroscent dengan ketinggian lampu dari dasar adalah 50 cm dan intensitas cahayanya telah terukur dengan alat light meter. Perubahan warna pada lempeng KLT diukur pada menit ke – 0, 1, 3, 6, 9, 12, dan 15. Uji ini dilakukan dengan 5 kali replikasi dan dihitung standar deviasi serta rata – rata perubahan warna.

8. Isolasi senyawa yang memiliki aktivitas penangkap radikal bebas, antibakteri, dan UV protection

a. Triturasi

1) Penyiapan sampel

Ekstrak kental ditimbang 5,0 gram dan dimasukkan ke dalam mortir yang telah ditimbang sebelumnya. Lima gram sea sand

ditambahkan pada mortir tersebut dan diaduk hingga homogen sambil diteteskan metanol sebanyak 1 – 2 tetes untuk memudahkan

pengadukan. Campuran tersebut kemudian didiamkan selama semalam di dalam lemari pendingin.

2) Triturasi dengan n-heksan

Campuran ekstrak kental rimpang kunyit dan sea sand

tersebut kemudian dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge. Lima mL n-heksan ditambahkan pada tabung sentrifuge tersebut, dicampurkan hingga homogen dengan vortex, dan kemudian disentrifugasi. Bagian larutan hasil dari sentrifugasi tersebut kemudian diambil dan disaring dengan menggunakan kertas saring Whatmann no. 42 yang akan ditampung di cawan porselen yang telah ditimbang sebelumnya. Langkah ini dilakukan hingga bagian larutan hasil sentrifugasi menjadi bening. Hasil filtrasi tersebut kemudian diuapkan di atas penangas air hingga seluruh pelarut teruapkan dan ditimbang kembali. Filtrat yang diperoleh disimpan di lemari pendingin dan disebut sebagai hasil triturasi n-heksan. 3) Triturasi dengan kloroform : metanol (95:5 v/v)

Campuran ekstrak kental rimpang kunyit dan sea sand sisa dari triturasi n-heksan dikeringkan dan dipindahkan ke tabung

sentrifuge baru. Kloroform : metanol (95:5 v/v) ditambahkan sebanyak 5 mL, dicampurkan hingga homogen dengan vortex, dan kemudian disentrifugasi. Bagian larutan hasil dari sentrifugasi tersebut kemudian diambil dan disaring dengan menggunakan kertas saring Whatmann no. 42 yang akan ditampung di cawan porselen

yang telah ditimbang sebelumnya. Langkah ini dilakukan hingga bagian larutan hasil sentrifugasi menjadi bening. Hasil filtrasi tersebut kemudian diuapkan di atas penangas air hingga seluruh pelarut teruapkan dan ditimbang kembali. Filtrat yang diperoleh disimpan di lemari pendingin dan disebut sebagai hasil triturasi kloroform : metanol (95:5 v/v).

4) Pengujian KLT ekstrak kental dan hasil triturasi

Masing – masing ekstrak kental rimpang kunyit, hasil triturasi n-heksan, dan hasil triturasi kloroform : metanol (95:5 v/v) ditimbang 2,5 mg yang kemudian diletakkan pada masing – masing tabung flakon. Masing – masing tabung flakon tersebut kemudian ditambahkan 500 µL etanol p.a dan diaduk hingga homogen. Setelah terlarut hingga homogen, masing – masing tabung flakon tersebut ditotolkan pada lempeng KLT dengan menggunakan mikrokapiler dengan jarak elusi 5 cm dan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Hasil elusi dibandingkan dan dihitung nilai Rf masing – masing bercak pada ekstak kental rimpang kunyit, hasil triturasi n-heksan, dan hasil triturasi kloroform : metanol (95:5 v/v).

b. Kromatografi kolom

Kromatografi kolom pada penelitian ini menggunakan metode elusi step – gradient chromatography.

1) Optimasi pelarut yang akan digunakan

Hasil triturasi n-heksan yang telah diperoleh tersebut ditimbang 2,5 mg dan dilarutkan dalam 0,5 mL n-heksan hingga tercampur homogen. Campuran tersebut kemudian ditotolkan pada lempeng KLT dengan jarak elusi 5 cm untuk masing – masing fase gerak. Fase gerak yang digunakan yaitu: n-heksan : kloroform (50:50 v/v), n-heksan : kloroform (25:75 v/v), kloroform, dan kloroform : metanol (98:2 v/v). Setelah dielusi, lempeng KLT tersebut kemudian diamati dan dibandingkan setiap fase gerak.

2) Preparasi sampel untuk kromatografi kolom

Hasil triturasi n-heksan ditimbang 300 mg dan dicampurkan dengan 300 mg silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm) hingga homogen.

3) Penyiapan kolom kromatografi

Bagian bawah kolom disumbat dengan kapas yang telah dibasahi dengan n-heksan. Kolom kemudian disusun dari bawah ke atas yaitu: silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm) di atas kapas tersebut dengan ketinggian sekitar 2 cm, sampel yang telah tercampur dengan silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm) dengan ketinggian sekitar 0,5 cm, silika gel 60 (0,040 – 0,063 mm) dengan ketinggian sekitar 1 cm, dan ditutup kembali dengan kapas yang telah terbasahi oleh n-heksan.

4) Kromatografi kolom dengan teknik elusi step - gradient

Kolom kromatografi yang telah siap digunakan dialirkan dengan 20 mL n-heksan : kloroform (75:25 v/v) dan dilanjutkan dengan 10 mL n-heksan : kloroform (50:50 v/v) yang ditampung dalam tabung flakon setiap 2 mL dari hasil kromatografi kolom tersebut. Setiap tabung flakon tersebut kemudian dicuplik untuk dilakukan KLT dengan menggunakan fase gerak kloroform dan profil KLT tersebut diamati.

5) Penggabungan isolat hasil kromatografi kolom

Nilai Rf masing – masing plat KLT hasil cuplikan tiap tabung flakon dari kromatografi kolom dihitung. Bercak yang memiliki nilai Rf yang sama dan pada profil KLT hanya menunjukkan satu bercak digabungkan dalam wadah tabung flakon lain yang telah ditimbang sebelumnya. Setelah itu, diuapkan di atas penangas air dengan suhu 50 dan ditimbang kembali untuk mengetahui bobot yang didapatkan serta dihitung pula rendemen yang diperoleh. Ketika hasil penggabungan isolasi tersebut telah pekat, maka langkah selanjutnya adalah memindahkannya ke tabung eppendorf dengan cara melarutkan isolat dengan pelarut yang sesuai sehingga diperoleh kadar 1 mg/ 100 µL dan kemudian diuapkan kembali, sehingga di dalam tabung eppendorf terdapat 1 mg isolat.

9. Uji kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas dan UV protection pada isolat

a. Preparasi sampel 1) Isolat pertama

Tabung eppendorf yang telah mengandung 1 mg isolat pertama tersebut dilarutkan dalam 1 mL n-heksan : kloroform (75 : 25 v/v).

2) Isolat kedua

Tabung eppendorf yang telah mengandung 1 mg isolat kedua tersebut dilarutkan dalam 1 mL n-heksan : kloroform (50 : 50 v/v).

b. Uji aktivitas penangkap radikal bebas DPPH secara KLT

Isolat pertama dan kedua tersebut ditotolkan pada lempeng KLT dengan volume penotolan 10 µL, 20 µL, dan 30 µL menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v) dan jarak elusi 5 cm. Lempeng KLT hasil elusi tersebut kemudian dikeringkan pada suhu ruang dan selanjutnya disemprot dengan pereaksi DPPH. Hasil positif ditandai dengan adanya bercak berwarna kuning – putih dengan latar ungu pada lempeng KLT.

c. Uji aktivitas UV protection dengan -carotene secara KLT

Larutan isolat pertama dan larutan isolat kedua dengan konsentrasi masing – masing larutan 1 mg/ mL yang telah disiapkan ditotolkan pada lempeng KLT untuk dielusi dengan jarak elusi 5 cm

menggunakan fase gerak kloroform : metanol (95 : 5 v/v). Lempeng KLT yang telah dielusi kemudian dicelupkan dengan pereaksi -carotene dan warna pada lempeng KLT tersebut diukur dengan menggunakan indikator warna. Setelah itu, lempeng KLT tersebut disinari dengan sinar UV dalam kotak fluoroscent dengan ketinggian lampu dari dasar adalah 50 cm dan intensitas cahaya telah terukur dengan light meter. Perubahan warna pada lempeng KLT diukur pada menit ke – 0, 1, 3, 6, 9, 12, dan 15.

10. Uji daya antibakteri dengan metode Kirby – Bauer a. Preparasi bahan

Pembuatan suspensi bakteri, kontrol media, dan kontrol pertumbuhan dilakukan seperti pengujian daya antibakteri sebelumnya, hanya saja pada metode Kirby – Bauer media agar yang digunakan adalah Mueller – Hinton agar. Pembuatan kontrol positif menggunakan amoksisilin dengan konsentrasi 1 mg/ mL dan volume yang digunakan pada paper disc yaitu 5 µL; 7,5 µL; dan 10 µL yang kemudian diletakkan ke dalam media agar yang telah diinokulasikan 100 µL bakteri.

b. Pengujian daya antibakteri dengan metode Kirby – Bauer

Satu miligram isolat pertama dan isolat kedua dalam tabung eppendorf hasil dari kromatografi kolom masing – masing dilarutkan dengan 1 mL n-heksan : kloroform (75 : 25 v/v) untuk isolat pertama dan 1 mL n-heksan : kloroform (50 : 50 v/v) untuk isolat kedua. Masing – masing isolat tersebut kemudian ditotolkan pada paper disc dengan

Keterangan:

K. Ekstrak kunyit dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 47 µg) A. Isolat 1 dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 10 µg)

B. Isolat 1 dengan volume penotolan 20 µL (mass loading = 20 µg) C. Isolat 1 dengan volume penotolan 30 µL (mass loading = 30 µg) D. Isolat 2 dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 10 µg) E. Isolat 2 dengan volume penotolan 20 µL (mass loading = 20 µg) F. Isolat 2 dengan volume penotolan 30 µL (mass loading = 30 µg)

b. Uji kualitatif UV protection 1) Penimbangan bahan

a) Penimbangan -carotene

Bobot -carotene = 0,0042 gram Konsentrasi -carotene =

= 0,0525 mg/ mL

b) Penimbangan ekstrak kunyit

Bobot ekstrak kunyit = 0,0047 gram

Konsentrasi ekstrak kunyit dalam etanol = =

4,7 mg/ mL

3) Optimasi intensitas cahaya

Ket. t (menit)

Replikasi ke –

(indikator ke - ) Rata -

rata SD 1 2 3 4 5

h = 100 cm max = 5,97 lux min = 5,82 lux Rata – rata = 5,895 lux

0 6 6 6 6 6 6 0,00

1 5 3 3 3 3 3,4 0,89

3 3 3 2 2 3 2,6 0,55

6 3 2 2 2 2 2,2 0,45

9 2 2 2 2 2 2 0,00

12 2 2 2 2 2 2 0,00

15 2 2 1 1 1 1,4 0,55

h = 50 cm max= 15,14 lux min = 14,88 lux Rata – rata = 15,01 lux

0 6 6 6 6 6 6 0,00

1 3 2 2 3 2 2,4 0,55

3 2 2 2 2 2 2 0,00

6 2 1 2 1 2 1,6 0,55

9 2 1 1 1 1 1,2 0,45

12 1 1 1 1 1 1 0,00

15 1 1 1 1 1 1 0,00

h = 35 cm max= 30,96 lux min = 30,00 lux Rata – rata = 30,48 lux

0 6 6 6 6 6 6 0,00

1 2 2 1 2 1 1,6 0,55

3 1 1 1 1 1 1 0,00

6 0 0 0 0 0 0 0,00

9 0 0 0 0 0 0 0,00

12 0 0 0 0 0 0 0,00

15 0 0 0 0 0 0 0,00

4) Uji aktivitas UV protection pada ekstrak kunyit

5) Uji aktivitas UV protection pada isolat

Isolat 1 Isolat 2 Keterangan:

K. Ekstrak kunyit dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 47 µg)

A. Isolat dengan volume penotolan 10 µL (mass loading = 10 µg) B. Isolat dengan volume penotolan 20 µL (mass loading = 20 µg) C. Isolat dengan volume penotolan 30 µL (mass loading = 30 µg)

c. Uji kualitatif antibakteri

1) Penimbangan bahan a) Ekstrak kental kunyit

Bobot ekstrak kental kunyit = 0,0047 gram

Konsentrasi ekstrak kunyit dalam etanol =

4,7 mg/ mL

b) Amoksisilin

Bobot amoksisilin = 0,0051 gram

Konsentrasi amoksisilin dalam aquadest =

= 5,1 mg/mL

2) Hasil pengamatan bioautografi kontak ekstrak kunyit terhadap E. coli dan S. aureus

Aktivitas antibakteri ekstrak kunyit terhadap E. coli

Aktivitas antibakteri ekstrak kunyit terhadap S. aureus Keterangan :

A. Ekstrak kunyit dengan volume penotolan 15 µL (mass loading = 75 µg)

B. Ekstrak kunyit dengan volume penotolan 20 µL (mass loading = 100 µg)

C. Ekstrak kunyit dengan volume penotolan 30 µL (mass loading = 150 µg)

A

A B B C

3) Hasil pengamatan uji daya antibakteri isolat terhadap S. aureus dengan metode Kirby – Bauer

A B

C D Keterangan :

A. Isolat pertama dengan volume penotolan 50 µL (mass loading = 50 µg) B. Isolat pertama dengan volume penotolan 100 µL (mass loading = 100 µg) C. Isolat kedua dengan volume penotolan 50 µL (mass loading = 50 µg) D. Isolat kedua dengan volume penotolan 100 µL (mass loading = 100 µg)

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Isolasi dan Identifikasi Golongan Senyawa Aktif Penangkap Radikal Bebas, Antibakteri, dan UV Protection Ekstrak Rimpang Kunyit (Curcuma longa L.)” memiliki nama lengkap Elyn Prameswari. Penulis lahir di Bogor pada tanggal 7 September 1993 sebagai putri ketiga dari tiga bersaudara pasangan Wasi Tedjo Radjatmo dan Ignatia Sukarti. Pendidikan Formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK Sandhy Putra Balikpapan (1997 – 1999), SD St. Aloysius Semarang (1999 – 2005), SMP Maria Mediatrix Semarang (2005 – 2008), SMA Kolese Loyola Semarang (2008 – 2011), dan kemudian melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2011.

Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis aktif dalam beberapa kegiatan diantaranya: bendahara Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi (2013 – 2014), ketua Komisi Pemilihan Umum Gubernur BEMF dan Ketua DPMF Farmasi (KPU 2013), sekretaris TITRASI (2013), sekretaris Donor Darah JMKI “We are One in Blood Donation (2012), anggota UKF basket (2011 – 2013), dan anggota UKM basket (2011 - 2012).

Penulis juga pernah memenangkan pertandingan basket di antaranya: Juara II Potensi MIPA Fair UII Se – DIY tahun 2012, juara III Farmasi Cup (Basketball Competition Fakultas/ Jurusan Kesehatan Se - DIY) tahun 2011, juara III, Farmasi UGM Cup tahun 2012, dan juara III Pharmacy Performance and Event Cup tahun 2012. Selain itu, penulis pernah menjadi Asisten Praktikum untuk matakuliah Bentuk Sediaan Farmasi dan Biokimia pada tahun 2013.