Macam-macam metode yang digunakan untuk analisa gelatin A.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta merupakan salah satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik KCKT didasarkan pada pengukuran luasarea puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luasarea standar. Pada prakteknya, pembandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar. Oleh karena itu, maka pembandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Hal ini karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan beragam. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang antara lain; farmasi, lingkungan dan industri-industri makanan. Kegunaan umum KCKT adalah untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian impurities dan analisis senyawa- senyawa yang tidak mudah menguap nonvolatil. KCKT paling sering digunakan untuk: menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat dan protein-protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan lain-lain. Prinsip kerja KCKT adalah sebagai berikut dengan bantuan pompa, fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor, cuplikan dimasukkan kedalam fasa gerak dengan penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase gerak dan fase diam. Fase gerak berupa zat cair yang disebut eluen atau pelarut, sedangkan fase diam berupa silika gel yang mengandung hidrokarbon Pare J.R.J., Belanger, J.MR, 1997. Instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukan sampel,kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam. KCKT banyak digunakan untuk analisis asam amino karena analisa memerlukan waktu yang singkat dan memberikan hasil yang tepat dan teliti. Untuk mendeteksi asam amino dapat digunakan detektor UV atau detektor fluoresen. Akan tetapi kebanyakan asam amino tidak mempunyai serapan baik didaerah ultraviolet atau didaerah visibel. Dalam hal ini asam amino harus diderivatisasi terlebih dahulu supaya membentuk derivat yang dapat menyerap cahaya UV, tampak, atau berfluoresensi Rediatning Kartini 1987, h. 2-3. Tujuan dari derivatisasi pada HPLC untuk meningkatkan deteksi, mengubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatogram yang lebih baik, mengubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik, dan menstabilkan analit yang sensitif. Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yaitu produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofotometri, proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin 100, produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi, serta sisa pereaksi untuk derivatisasi tidak mengganggu ketika pemisahan pada kromatografi Abdul Rohman et al., 2007 . Ada dua macam derivatisasi yaitu derivatisasi pascakolom dan derivatisasi prakolom. Beberapa metode menggunakan pacakolom derivatisasi di mana asam amino yang dipisahkan pada kolom pertukaran ion diikuti dengan derivatisasi dengan ninhidrin, o- phthalaldehyde. Pada derivatisasi pascakolom, pemisahan asam amino berdasarkan pertukaran ion antara gugus amino yang terprotonasi dengan ion Na + UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dari resin penukar kation R-SO 3 -NA + pada pH rendah. Pendekatan lain adalah untuk derivatisasi asam amino sebelum pemisahan pada kolom HPLC fase terbalik seperti fenil isothiosianat; 6-amino-quinolil- N-hidroksisuccinimidil karbamate; 9-fluorenil metil kloroformate Cooper et al.,vol. 159. Pada kromatografi fase terbalik, silika non polar dimodifikasi melalui perlekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang berupa atom karbon 8 atau 18 dan menggunakan pelarut polar berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk interaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der waals. Senyawa ini juga kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan waktu untuk pemutusan hidrogen, sehingga senyawa non polar akan tertahan lebih lama di dalam kolom, sedangkan molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

C. PCR Polymerase Chain Reaction

PCR Polymerase Chain Reaction merupakan suatu metode amplifikasi DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida dengan bantuan enzim polymerase, dimana potongan DNA tertentu dapat dilipat gandakan Zyskind dan Bernstain, 1992. Metode ini paling banyak dipelajari dan digunakan secara luas. Dalam waktu sembilan tahun sejak pertama kali dikemukakan oleh ilmuan dari Cetus Corporation, Kary Mullis, PCR telah berkembang menjadi teknik utama dalam laboratorium biologi molekuler, antara lain untuk transkripsi in vitro dari PCR template, PCR rekombinan, DNAse I footprinting, sequencing dengan bantuan phage promoters, dan sebagainya Putra, 1999. Menurut Sambrook et al., 2001, tahapan yang terjadi dalam proses amplifikasi DNA pada PCR yaitu pemisahan denaturasi rantai DNA template, penempelan annealing pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan extension primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA polimerase. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

D. SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel

Electrophoresis 2.7.5 Prinsip Umum Elektroforesis Pemisahan senyawa dengan gel ektroforesis dilakukan berdasarkan perpindahan molekul bermuatan karena pengaruh medan listrik. Suatu molekul bermuatan Q dalam medan listrik berkekuatan x akan bergerak dalam kecepatan v karena mengalami gaya sebesar qx. Jika f merupakan koefisien gesekan friksi, maka molekul tersebut akan mengalami gaya hambat sebesar vf, sehingga qx = vf. Koefisien gesekkan menurut Stoke sebagai berikut: F = 6 π n v dengan demikian laju molekulnya sebagai berikut: n : Viskositas r : Jari – jari Mobilitas elektroforesis terutama tergantung pada kekentalan medium n, ukuran atau bentuk r, dan muatan molekul q. tanda dan besarnya muatan yang dibawa oleh gugus –gugus yang terionisasi bervariasi, tergantung pada kekuatan ionic dan pH medium. Oleh karena itu, pemisahan molekul –molekul efektif dengan cara menyeleksi terlebih dahulu medium yang tepat Bintang, 2010.

2.7.6 Faktor – Faktor Yang Mempengaruhi Elektroforesis

2.7.6.1 Medium Penyangga

Teknik elektroforesis dapat dibagi menjadi dua bagian, yaitu elektroforesis free boundary dan elektroforesis zona. Elektroforesis free boundary merupakan pemisahan parsial dalam tabung gelas vertikal dari campuran protein yang membentuk suatu boundary dengan bufer yang sesuai. Penerapan arus listrk menghasilkan pergerakan protein, karena terjadi migrasi dengan laju yang berbeda maka protein akan terpisah Bintang, 2010. v = q x 6 π n v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Pada elektroforesis zona, dengan melakukan pemisahan pada medium penyangga seperti gel poliakrilamid, akan diperoleh pita protein yang lebih stabil. Konsentrasi gel harus disesuaikan agar tidak terlalu encer dan juga tidak terlalu padat Bintang, 2011. Pada elektroforesis dalam matriks gel poliakrilamid, protein memisah ketika protein bergerak melalui matriks tiga dimensi dalam medan listrik. Matriks poliakrilamid berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH buffer agar muatan protein tidak berubah Fatchiyah, 2011.

2.7.6.2 Sampel

Larutan yang dipisahkan mempengaruhi laju migrasi termasuk muatan, ukuran, dan bentuk molekul terlarut. Muatan total akan meningkat apabila laju migrasi meningkat, besarnya muatan biasanya tergantung pada pH. Ukuran molekul yang lebih besar menyebabkan migrasi menurun dan kekuatan elektrostatika disekitar larutan meningkat, sedangkan bentuk molekul yang berbeda dengan ukuran yang sama seperti protein globular dan fibrous dikarakteristik menghambat migrasi, karena perbedaan bentuk molekul dapat mempengaruhi pergerakan molekul dan kekuatan elektrostatik Bintang, 2010. Protein merupakan molekul amfoter karena mempunyai gugus amino positif dan karboksil negatif. Dengan demikian, protein dapat mengion, baik pada pH basa maupun pada pH asam. Pada pH rendah, protein bersifat sebagai kation bermuatan positif yang cenderung bergerak kearah katoda elektroda negatif. Pada pH tinggi, protein bersifat sebagai anion bermuatan negatif yang cenderung bergerak kearah anoda elektroda positif. Nilai diantara kedua pH tersebut dinamakan titik isoelektrik isoelectric point atau pI yaitu nilai pH dimana protein menjadi tidak bermuatan. Pada pH tersebut, jumlah muatan negatif yang dihasilkan dari proteolisis sebanding dengan jumlah muatan positif yang diperoleh dari penangkapan proton. Protein yang tidak bermuatan tidak dapat bergerak pada medan listrik Fatchiyah, 2011. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Hampir semua protein mempunyai pH kurang dari 8,0. Oleh karena itu, pH buffer elektroforesis yang berkisar 8 –9 akan menyebabkan sebagian besar protein bermuatan negatif yang akan bergerak ke anoda Fatchiyah, 2011.

2.7.6.3 Buffer

Sistem bufer digunakan untuk mempertahankan pH didalam reservoir dan didalam medium penyangga, disamping itu sistem bufer berfungsi sebagai elektrolit pembawa aliran listrik. Bufer yang digunakan harus berinteraksi dengan molekul yang dipisahkan dan pH yang digunakan harus sesuai sehingga campuran molekul dapat dipisahkan satu sama lain tetapi tidak mengakibatkan denaturasi. pH dipilih berdasarkan jenis campuran yang akan dipisahkan, umumnya pemisahan maksimal dapat dicapai pada titik isolistrik Bintang, 2010. Kekuatan ionik larutan bufer biasanya berada pada kisaran 0,05 – 0,15 dan biasanya diambil nilai diantara kedua nilai ekstrem. Pada kekuatan ionik yang rendah akan terjadi pergerakan molekul yang cepat dan produksi panas yang rendah dan terjadi difusi yang nyata. Sedangkan pada kekuatan ionik yang tinggi, diperoleh pita –pita yang tajam, namun akan terjadi produksi panas yang lebih tinggi dan terjadi pergerakan molekul pada jarak yang pendek Bintang, 2010.

2.7.6.4 Medan Listrik

Sumber arus listrik yang stabil diperlukan untuk menghasilkan aliran listrik dengan voltase yang konstan. Kekuatan ionik medan listrik pada kisaran 2 –8 V cm sesuai untuk suhu ruang. Apabila kekuatan medan magnet lebih besar dari 10 V cm, maka akan terjadi kehilangan air yang besar karena proses penguapan akibat dari panas yang ditimbulkan. Larutan bufer kemudian dialirkan kedalam tangki penyangga untuk menggantikan air yang hilang, dan ini mengakibatkan pergeseran pita – pita. Pemanasan yang berlebih menyebabkan senyawa terdenaturasi. Metode –metode pendinginan medium pemisahan dapat dilakukan, sehingga kekuatan medan 100V cm dapat digunakan. Keuntungan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta elektroforesis pada voltase tinggi adalah terjadinya pemisahan yang cepat Bintang, 2010.

2.7.7 SDS-PAGE Sodium

Dodecyl Sulphate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu campuran berdasarkan atas pergerakan partikel koloid yang bermuatan, dibawah pengaruh medan listrik. Cara elektroforesis telah digunakan untuk analisa virus, asam nukleat, enzim dan protein lain, serta molekul-molekul organik dengan berat molekul rendah seperti asam amino Westermeier, 2004. Sodium Dodecyl Sulfate Poliacrylamide Gel Electrophoresis SDS- PAGE merupakan elektroforesis gel untuk memisahkan molekul protein dengan metode two-dimensional gel electrophoresis yaitu menggunakan dua macam gel dengan masing-masing bufer yang berbeda. Gel yang digunakan pada SDS-PAGE adalah running gel dan stacking gel Gambar 7. Prinsip SDS-PAGE adalah memisahkan molekul protein berdasarkan berat molekul Alberts et al, 2002. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Gambar 7. Skema Alur Elektroforesis Sumber: Bintang, 2010 Sodium Dodecyl Sulfate SDS adalah deterjen yang mampu menghambat interaksi hidrofobik antar molekul serta melarutkan molekul yang hidrofobik tersebut. Sodium Dodecyl Sulfate SDS berfungsi untuk mendenaturasi protein dalam bentuk protein kompleks kuarterner, tersier, dan sekunder menjadi bentuk yang lebih sederhana primer atau linear. Sodium Dodecyl Sulfate SDS juga mengubah seluruh muatan protein menjadi negatif Seidman Moore, 2002: 583. Hal ini seperti terlihat pada Gambar 8. Gambar 8. Konformasi protein sebelum dan setelah penambahan SDS Sumber: Davidson, 2001 Menurut Dunn 1989, protein yang terdenaturasi sempurna akan mengikat SDS dalam jumlah yang setara dengan berat molekul protein tersebut. Elektroforesis gel SDS dilakukan pada pH sekitar netral dengan adanya β-merkaptoetanol untuk mereduksi semua ikatan disulfida dalam rantai yang ada pada protein menjadi gugus sulfihidril.