UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.4.5 Ekstraksi Gelatin
Sebanyak 10 g masing-masing sampel A, B dan simulasi gummy ditimbang dan ditambahkan 50 mL aquadest dalam tabung reaksi
kemudian dipanaskan dalam waterbath pada suhu 60°C. Setelah larut kemudian sampel dan simulasi disentrifuge pada 6000 rpm selama 30
menit. Supernatant yang sudah jernih dipipet dan dipindahkan pada tabung reaksi baru dan ditambahkan aseton dengan perbandingan 1:4 v: v,
gelatin praktis tidak larut dalam aseton, supernatan akan menggumpal dengan penambahan aseton. Kemudian sampel dan simulasi yang telah
ditambahkan aseton disentrifuge kembali pada 6000 rpm selama 30 menit. Gumpalan gelatin yang terbentuk diambil dan disimpan dalam cawan
penguap dengan label dan ditutup alumunium foil, kemudian dioven pada suhu 50 °C selama 1 jam. Endapan kering kemudian ditimbang dan
disimpan dalam suhu ruang Azira et al., 2012 dengan modifikasi. Gelatin hasil ekstraksi yang didapatkan adalah simulasi gelatin babi 225 mg,
simulasi gelatin sapi 276 mg, sampel A 124 mg dan sampel B 115mg
3.4.6 Hidrolisis Gelatin
Gelatin standar, sampel dan simulasi yang didapat dari masing- masing hasil ekstraksi ditimbang sebanyak 100 mg secara akurat dan
dimasukkan kedalam centrifuge tube 50 mL dan ditambahkan 5 mL buffer asetat 0,1 N pH 4,5 gelatin dilarutkan. Kemudian dibuat larutan pepsin, 3
mg enzim pepsin ditimbang dan dilarutkan dalam 1 mL buffer dalam tabung reaksi. Sebanyak 1 mL masing-masing gelatin sampel dan simulasi
yang telah ditambahkan buffer asetat dimasukkan kedalam tabung eppendorf 2 mL, kemudian masing-masing tabung ditambahkan 20 µL
larutan pepsin. Sebagai kontrol digunakan larutan gelatin standar tanpa penambahan enzim. Selanjutnya masing-masing tube diinkubasi pada suhu
60ºC selama 1 jam. Setelah diinkubasi kemudian gelatin sampel dan simulasi didinginkan pada suhu ruang dan ditambahkan NaOH 0,01 M
sebanyak 200 µL pada masing-masing sampel dan simulasi. sampel dan simulasi siap dielektrorofsis Hermanto et al, 2013 dengan modifikasi.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.5 Elektroforesis
Running buffer dimasukkan ke dalam wadah elektroforesis. Pada saat penambahan running buffer dilakukan secara hati-hati untuk
mencegah terbentuknya gelembung udara. Running Buffer ditambahkan sampai melebihi batas atas sumuran.
Larutan sampel dan simulasi gummy vitamin c yang telah dihidrolisis masing-masing dipipet menggunakan mikropipet f10 sebanyak
10µl dan dimasukkan kedalam tabung effendorf. Kedalam masing-masing tabung ditambahkan buffer sample sebanyak 10µl, tabung kemudian
dipanaskan dalam waterbath pada suhu 60°C selama 5 menit, kemudian dipipet menggunakan mikropipet f10 sebanyak 10 µl dan dimasukkan
kedalam sumuran gel elektroforesis. Hames, 1998. Urutan kolom gel eletroforesis adalah sebagai berikut kolom 1
marker protein, kolom 2 standar gelatin sapi, kolom 3 standar gelatin babi, kolom 4 simulasi gummy gelatin sapi, kolom 5 simulasi gummy gelatin
babi, kolom 6 sampel A, kolom 7 sampel B dan kolom 8 standar gelatin sapi tanpa hidrolisis enzim.
Peralatan elektroforesis disambungkan pada power pack. Anoda kutub positif dihubungkan dengan reservoir atas dan katoda kutub
negatif dihubungkan dengan reservoir bawah, elektroforesis pada 200 volt, 15mA. Running dilakukan sampai batas gel, 1 cm dari batas bawah
resolving gel. Proses elektroforesis berlangsung selama 60 menit. Setelah proses elektroforesis selesai gel diwarnai dengan 0,05
wv comassie blue R-250 dalam methanol 15 vv dan asam asetat 5 vv pewarnaan dilakukan diatas shaker selama 1 jam, gel kemudian
diangkat dan direndam dalam campuran methanol 40, asam asetat 7,5 dan aquadest 52 didalam wadah. Proses perendaman dilakukan diatas
shaker selama 10 jam. Gel kemudian diangkat dan dilakukan identifikasi pita-pita yang terbentuk Hames, 1998.
3.6 Analisa Profil Gelatin Hasil SDS-PAGE
Gelatin yang telah dielektroforesis kemudian di scan. Pita-pita yang terbentuk pada gel elektroforesis diamati dan dibandingkan dengan
Kategori