3. Semua perlengkapan yang dipakai di dekontaminasi dengan cara yang sama dan diletakkan dekat atau dalam cabinet.
4. Larutan yang perlu dihangatkan menggunakan waterbath sebelum penggunaan. 5. Pekerja laboratorium mengenakan perangkat protektif personal.
6. Sarung tangan untuk bekerja dalam cabinet harus disemprot untuk dekontaminasi. 7. Semua yang akan kontak dengan sel atau reagen yang digunakan dalam kultur atau
pasasi harus steril autoclave atau filter sterilized.
b. Isolasi keratinositfibroblast dari jaringan kulit.
1. Sampel yang digunakan adalah preputium manusia yang diambil dari rumah sunatan.
2. Potongan sampel kulit direndam dalam medium transport
α MEM+ antibiotik + gentamicyn, disimpan semalam pada 4
o
3. Sampel kulit dimasukkan ke ruang steril, dibersihkan terlebih dahulu dengan betadine
2 x 2 menit dan alkohol 2 x 2 menit. C sebelum dipergunakan, tidak lebih dari 24
jam.
4. Sampel kulit kemudian dibersihkan lagi pada laminar flow dengan HBSS 2x
pencucian. 5.
Disiapkan peralatan: 2 pinset salah satu ujungnya bergigi, gunting, scapel pisau bedah, cawan petri, dan petridish 35 mm.
6. Dipipet HBSS sebanyak 2 mL ke dalam cawan, sampel kulit diletakkan dengan posisi
epidermis di atas dan dermis di bawah. 7.
Dipisahkan kulit dari lemak-lemak dan pembuluh darah yang menempel perlahan- lahan dengan pinset yang ada giginya diujung dan penjepit, hingga tinggal lapisan
dermis yang agak kebiru-biruan, diusahakan tidak sampai sobek. 8.
Sampel kulit dibalik, lapisan epidermis di atas, dipotong-potong memanjang, dengan ukuran 0,5 x 2 cm.
9. Potongan kulit dimasukkan ke dalam dish 35 mm, tiap cawan berisi 4-5 potong,
dituang larutan dispase I enzim untuk melepaskan bagian dermis dari epidermis 2 mL, yang telah diencerkan denagan PBS 2 mL, dibiarkan mengambang, bagian
epidermis jangan terendam. Disimpan dalam freezer semalaman 4
o
10. Disimpan di dalam inkubator 37 C, 18-20 jam.
o
11. Disiapkan alat dan bahan seperti conical tube 15 mL, HBSS, trypsin 0,25, cawan petri, dan pipet tips 1000 µL.
C, untuk diperiksa keesokan harinya.
Universitas Sumatera Utara
12. Dipipet 3 mL HBSS, dituang ke dalam tube 15 mL + 2 mL trypsin. 13. Dipisahkan kulit dari lapisan dermis dan epidermis, dimasukkan ke dalam tube 15 mL
dan dimasukkan ke dalam inkubator selama 30 menit. 14. Setiap 5 menit dikocok-kocok sel sebanyak 10x hingga merata.
15. Larutan dalam inkubator tadi diinaktivasi dengan medium α MEM, PSAG 20,
FBS sebanyak 5 mL, 1:1, dimasukkan ke dalam tube 50 mL. 16. Kemudian larutan ditriturasi homogenkandipipet naik turun dan saring dengan filter
70 µm pada tube 50 mL, lalu dibilas dengan HBSS sebanyak 5 mL. 17. Larutan dipipet dan dipindahkan ke tube 15 mL, disentrifuse 1500 rpm selama 20
menit. 18. Setelah itu larutan supernatan dibuang, endapan difliking dijentik-jentik,
ditambahkan HBSS sebanyak 6 mL. 19. Larutan disentrifuse kembali dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit,
20. Suspensi sel ditriturasi dicampur dengan pipet 10 mL, dan sel siap dihitung dengan hemocytometer.
21. Cara perhitungan sel:
80 μLPBS + 10 μL trypan blue + 10 μL sel
……………….. 3.1 22. Sebelum sel dimasukkan ke dalam dish, terlebih dahulu dish dilapisi dengan kolagen,
dengan cara kolagen dimasukkan ke dalam dish, didiamkan selama 1 jam dalam inkubator.
23. Setelah itu, sel yang telah ditambahkan epilife dimasukkan ke dalam dish. 24. Kemudian dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 37
o
C, 5 CO
2
.
c. Pergantian medium
