90, 5 CO
2
3. Mikroskop Axio Observer A1+
Camera Axio Zeis
4. Komputer + Monitor
HP Hewlet Packard 5.
Tabung gas CO
2
6. Microcentrifuge
Hettich type 200R 7.
Hemocytometer
Ruang Antara
1. Lemari gantung besi
Lion 2.
Lemari box besi tempat baju lab, masker, sarung tangan, tutup kepala.
Lion
1. Pengamatan FTIR Fourier-Transformed Infra-Red Spectroscopy FTIR, spektrum infra-red dari scaffold
dapat diperoleh dari spektrofotometer spectrum 100 PERKIN ELMER.
2. Pengamatan mikrostruktur Scanning Electron Microscopy SEM, Cambridge stereoscan 260.
3. Pengamatan degradasi termal Thermogravimetri Analisys TGA atau Differensial Scanning Calorimetri DSC
2010; TA Instrument, New Castle, DE. 4.
Uji pertumbuhan sel di atas scaffold Mikroskop inverted.
3.3 Variabel Penelitian
Pada tahap proses pengolahan scaffold collagen-kitosan kondisi variabel adalah sebagai berikut:
Variabel tetap: 1. Kitosan dari jenis cangkang belangkas
2. Kolagen dari jenis daging sapi 1 bovine tendon 3. Konsentrasi kolagen dan kitosan dalam asam asetat : 0,5
Universitas Sumatera Utara
4. Derajat deasetilasi kitosan: 90,2 5. Konsentrasi asam asetat: 1
6. Waktu pengeringan : 96 jam 7. Tekanan Freeze dryer : 105 mtorr.
8. Suhu Freeze dryer : -40
o
9. Konsentrasi larutan GA: 0,25 C
Variabel bebas: 1. Variasi perbandingan kitosankolagen ww : 0:100, 20:80, 40:60, 50:50, 60:40,
80:20, 100,0 Variabel terikat:
- Uji FTIR. - Uji Mikrostruktur SEM.
- Uji Termal TGA. - Kultur Sel perhitungan jumlah sel.
- Uji Pertumbuhan sel diatas scaffold Mikroskop inverted.
3.4 Prosedur Penelitian
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap: 1. Pengolahan scaffold kolagenkitosan
2. Pengolahan cross-linking scaffold kolagenkitosan 3. Pengamatan mikrostruktur
4. Uji pertumbuhan sel diatas scaffold.
3.4.1 Pengolahan Scaffolds kolagenkitosan
Langkah proses pengolahan scaffold kitosankolagen dengan metode freeze- drying adalah sebagai berikut:
a. Kolagen atau kitosan masing-masing dilarutkan dalam larutan asam asetat 1 untuk membuat larutan 0,5 bb, larutan kitosan ditambahkan ke dalam suspensi kolagen
perlahan dengan variasi perbandingan berat kitosan : kolagen = 0:100, 20:80, 40:60, 50:50, 60:40, 80:20, 100:0, dan diaduk untuk diperoleh campuran yang
homogen. b. Campuran kitosankolagen diinjeksikan ke dalam cetakan diameter: 7cm x 7cm x
Universitas Sumatera Utara
5mm. Gelembung udara dihilangkan dari permukaan campuran. c. Campuran dibekukan pada suhu kamar selama 48 jam, kemudian dimasukkan dalam
alat freeze dryer pengering beku pada suhu -40
o
3.4.2 Pengolahan Cross-linking Scaffold KolagenKitosan
C, tekanan 105 mtorr selama 48 jam.
Langkah proses pengolahan untuk meningkatkan biostability scaffold kitosankolagen adalah sebagai berikut:
1. Semua scaffold direhidrasi dalam larutan asam asetat 0,05 M selama 15 menit, kemudian dicross-linked dalam larutan GA doubledistilled water, pH 5,6 dengan
konsentrasi 0,25 , pada suhu 4
o
2. Setelah dicuci dengan doubledistilled water setiap 10 menit, sebanyak 5 kali. C selama 24 jam.
3. Scaffold di freeze-drying lagi untuk mendapatkan scaffold kitosankolagen yang telah diolah dengan GA.
4. Campuran beku scaffold dilepaskan perlahan dari cetakan dan disimpan dalam tempat yang kedap udara.
5. Selanjutnya Scaffold kitosankolagen siap untuk diuji SEM, TGA, FTIR dan uji biologi.
3.4.3 Uji FTIR
Fourier-Transformed Infra-Red Spectroscopy FTIR, spektrum infra-red dari scaffold dapat diperoleh dari spektrofotometer spectrum 100 PERKIN ELMER pada
range bilangan gelombang 4000-650 cm
-1
. Dari spektrum ini dapat dilihat kemungkinan interaksi kedua polimer dalam sampel campuran Fernandes, 2011.
3.4.4 Pengamatan Mikrostruktur
Struktur mikro scaffold dapat diamati antara lain dengan alat Scanning Electron Microscopy SEM, Cambridge Stereoscan 260, Cambridge Instrument Ltd., Cambridge,
UK setelah diolah scaffold berpori diolah dengan 2,5 bb GA selama 20 menit, diikuti dengan dehidrasi dengan etanol. Spesimen dikeringkan dalam suatu alat critical-
point peralatan pengering. Sampel dilapisi dengan gold-palladium kira-kira 2-5 nm dan dianalisa dengan SEM Han, 2010.
3.4.5 Uji Termal dengan TGA
Universitas Sumatera Utara
Stabilitas termal dapat diuji dengan Thermogravimetric TG dan Differential Thermogravimetric DTG. Kurva TGDTG diperoleh dalam atmosfir nitrogen,
menggunakan TGA Pyris 1 TGA PERKIN ELMER, dengan laju pemanasan 10
o
Cmenit, dari temperatur kamar sampai 700
o
C Fernandes, 2011
3.4.6 Kultur Sel
Pada studi ini digunakan epidermis dari preputium manusia. Sebelum mulai bekerja dengan sel-sel, dipastikan bahwa sejumlah medium, buffer dan enzim yang
dibutuhkan telah dipra-hangat setidaknya sampai suhu kamar. Selalu menggunakan instrumen steril, teknik aseptik, dan bekerja di sebuah aliran laminar untuk
mempertahankan sterilitas.
a. Persiapan bahan dan alat.
Larutan: 1. Hank’s Balanced Salt Solution atau larutan sejenis disimpan pada suhu 4
o
C atau - 20
o
2. PBS 1-10x bebas Ca dan Mg, dapat ditambahkan glukosa 0,01 vv. C.
3. Trypan blue, dilarutkan dalam PBS hingga mencapai larutan 0,1 wv, dilewatkan pada filter sterilisasi 0,22 µm.
4. EDTA dilarutkan dalam PBS hingga mencapai konsentrasi 0,02 0,53 mM. 5. Trypsin dilarutkan dalam HBSS atau PBS sampai konsentrasi 0,1 penggunaan
pada suhu 37
o
C, penyimpanan dalam suhu 4
o
C semalam lalu aliquot 40 mL dan disimpan pada suhu -20
o
6. Trypsin EDTA: campuran antara 0,05 trypsin + 0,53 mM EDTA melalui filter sterilisasi.
C.
7. α MEM disimpan pada suhu 4
o
8. FBS aliquot 50 mL dan disimpan pada suhu -20 C.
o
C Mycoplasma-free lownegative endotoxin, bila perlu dapat diinaktivasi dengan inkubasi pada 56
o
C selama 30 menit sambil diaduk lalu harus didinginkan pada 4
o
9. Larutan stok 100x penisillin-strptomicin dialiquot 5 mL dan disimpan pada -20 C semalam, baru
dialiquot.
o
10. Larutan stok 200 mM pada konsentrasi 0,29 mgmL L-Glutamin di aliquot dan disimpan pada 20
C.
o
11. Insulin 50 mgml dilarutkan dalam 0,05M HCl disimpan dalam 10 mL aliquot C, segera digunakan dalam 1 minggu.
Universitas Sumatera Utara
pada 4
o
12. EGF 10 µgml dilarutkan dalam ddH C.
2
O.
Komposisi Complete medium CM 50mL untuk sel fibroblast : 1. 25 mL
α Modified Essential Medium α MEM 1x dalam ddH2O. 2. 0,5 mL FBS
3. 0,5 mL Amphotericyn 4. 0,5 mL Penicillin Streptomicyn
5. 0,5 mL FGF 10 ugml dalam ddH2O 6. + PBS sampai 50 mL
untuk 50 mL CM = 25 mL α MEM : 20 PSAG+5mL FBS= 1:1
Komposisi Complete medium CM 50 mL untuk sel keratinosit: 1. 25 mL Epilife
2. 0,5 mL FBS 3. 0,5 mL Amphotericyn
4. 0,5 mL Penicillin Streptomicyn 5. 0,5 mL EGF 10 ugml dalam ddH2O
6. + PBS sampai 50 mL
Precoating: 1. 100 µgmL kolagen tipe IV100 µgmL fibronectin dalam PBS sebanyak 3-5 mL pada
cawan kultur 100 mm, diinkubasi 1 jam pada 37
o
C atau inkubasi semalam pada suhu 4
o
2. Lalu dicuci 3 kali dengan PBS. Diinkubasi dengan BSA 0,5 mgmL pada 37 C.
o
3. Lalu dicuci 2 kali dengan PBS dan ditambahkan 2 mL CM dan dihangatkan pada 37
C selama 1 jam.
o
C.
Sterilisasi pra-aktivasi laboratorium: 1. Biological safety cabinet dinyalakan dan dibiarkan selama 15 menit.
2. Semua permukaan tempat kerja di dalam safety cabinet di dekontaminasi dengan ethanol 70.
Universitas Sumatera Utara
3. Semua perlengkapan yang dipakai di dekontaminasi dengan cara yang sama dan diletakkan dekat atau dalam cabinet.
4. Larutan yang perlu dihangatkan menggunakan waterbath sebelum penggunaan. 5. Pekerja laboratorium mengenakan perangkat protektif personal.
6. Sarung tangan untuk bekerja dalam cabinet harus disemprot untuk dekontaminasi. 7. Semua yang akan kontak dengan sel atau reagen yang digunakan dalam kultur atau
pasasi harus steril autoclave atau filter sterilized.
b. Isolasi keratinositfibroblast dari jaringan kulit.
