Kultur sel fibroblast manusia pada scaffold kitosankolagen

5. Digunakan mikroskop dengan perbesaran 10x-40x 6. Sel dihitung yang bright clear viable dan kebiruan non viable pada seluruh ruangan 1mm 2 7. Dihitung jumlah sel viable dan non viable dengan rumus berikut: minimal, selesai dalam 5 menit setelah pencampuran trypan blue. 80 μLPBS + 10 μL trypan blue + 10 μL sel ………………… 3.2 A = rerata jumlah sel viable B = rerata jumlah sel non-viable C = 5, faktor dilusi 10 4 AxCxD = Konsentrasi sel viable per mL = faktor koreksi. BxCxD = Konsentrasi sel non viable Total jumlah sel viable = sel viable x vol Total jumlah sel = jumlah sel viable + jumlah sel non viable Persentase viabilitas = jumlah sel viable x 100total jumlah sel. Isolasi keratinosit menghasilkan jumlah sel berkisar 10 6 , kepadatan sel yang ditanam biasanya 20.000 selcm 2 .

f. Kultur sel fibroblast manusia pada scaffold kitosankolagen

1. Disiapkan dish 35mm, gunting, pinset, alkohol 70, dan larutan PBS. 2. Scaffold dipotong dengan ukuran 2cmx2cm dengan gunting steril. 3. Dilakukan sterilisasi scaffold kitosankolagen dengan mencuci dalam alkohol 70, diikuti dengan membilas dengan larutan PBS, diamkan hingga scaffold terendam ke dasar dish. Larutan PBS dibuang, dan diratakan permukaan scaffold di atas dish, diinkubasi semalaman. 4. Dipipet suspensi sel 50.000-10.000 sel diatas scaffold, 2 tetes, usahakan suspensi sel tidak turun dari permukaan scaffold, amati di bawah mikroskop dan foto. 5. Ditambahkan medium kultur 2 ml hingga scaffold terendam seluruhnya, inkubasi dilanjutkan hingga hari ke-7. 6. Pengamatan pertumbuhan sel diatas scaffold dilakukan pada hari 1-7. Setiap Universitas Sumatera Utara perubahan bentuk sel difoto dan dicatat.

I. Bagan Penelitian

1.1 Proses pengolahan scaffold kolagenkitosan yang di-cross-linked dengan GA 1.2 Kultur Sel larutan kolagenkitosan dalam 1 asam asetat, dengan perbandingan berat divariasikan ww 10:0, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 3:7, 4:6, 2:8, 0:10 Larutan Biomakromolekul Kolagen dalam asam asetat 0,5 bv Larutan Biomakromolekul Kitosan dalam asam asetat 0,5 bv - larutan kitosan dituangkan ke dalam suspensi kolagen dengan variasi perbandingan berat dan diaduk, dihomogenisasi untuk memperoleh blending kolagenkitosan. dicrosslink dengan larutan GA wv konsentrasi 0,25, 1,5 dari berat total polimer - Disentrifuse untuk menghilangkan bagian- bagian yang tidak larut. - Gelembung air dihilangkan. - Larutan diinjeksikan ke dalam cetakan kaca 7x7 mm, tebal 5 mm - Scaffold kemudian difreeze drying selama 48 jam, - 40 o C, tekanan 105 torr. - Scaffold dilepaskan dari cetakan perlahan - Setelah itu dicuci dengan double distilled water setiap 10 menit sebanyak 5x. - Scaffold dikeringkan lagi - Scaffold disimpan dalam tempat yang kedap udara, siap untuk diuji. Gambar 3.1 Bagan proses pengolahan scaffold kitosankolagen yang di-cross-linked dengan GA Scaffold kolagenkitosan Blending homogen kolagenkitosan Scaffold kolagenkitosan yang dicrosslink dengan GA Uji Mikro struktur SEM Uji FTIR Cell culture Scaffold kolagenkitosan yang dicrosslink dengan GA kering Blending homogen kolagenkitosan dalam cetakan Uji Termal TGA Uji pertumbuhan sel di atas scaffold - Scaffold didiamkan pada suhu kamar, sampai mengeras, selama 48 jam. Universitas Sumatera Utara a. Tahap Isolasi Sampel preputium manusia Preputium yang masih mengandung lemak dan pembuluh darah Preputium steril - Potongan sampel kulit direndam dalam medium transport a MEM + antibiotik + gentamicyn, disimpan semalam pada 4 o C sebelum dipergunakan, tidak lebih dari 24 jam. - Sampel kulit dimasukkan ke ruang steril, dibersihkan terlebih dahulu dengan betadine 2 x 2 menit dan alkohol 2 x 2 menit. - Sampel kulit kemudian dibersihkan lagi pada laminar flow dengan HBSS 2 x pencucian. - Disiapkan peralatan: 2 pinset salah satu ujungnya bergigi, gunting, scapel pisau bedah, cawan petri, dan petridish 35 mm. - Dipipet HBSS sebanyak 2 mL ke dalam cawan, sampel kulit diletakkan dengan posisi dermis diatas dan epidermis dibawah. - Dipisahkan kulit dari lemak-lemak dan pembuluh darah yang menempel perlahan-lahan dengan pinset yang ada giginya Larutan HBSS 2 mL - Dipisahkan kulit dari lemak-lemak dan pembuluh darah yang menempel perlahan-lahan dengan pinset yang ada giginya diujung dan penjepit, hingga tinggal lapisan dermis yang agak kebiru- biruan, diusahkan tidak sampai sobek. - Sampel kulit dibalik, lapisan epidermis diatas, dipotong-potong memanjang, dengan ukuran 0,5 x 2 cm. - Potongan kulit dimasukkan ke dalam dish 35 mm, tiap cawan berisi 4-5 potong, dituang larutan dispase I enzim untuk melepaskan bagian dermis dari epidermis 2 mL, yang telah diencerkan denagan PBS 2 mL, dibiarkan mengambang, bagian epidermis jangan terendam. - Disimpan dalam freezer semalaman 4 o C, 18-20 jam. - Disimpan di dalam inkubator 37 o C, untuk diperiksa keesokan harinya. Potongan dermis dan epidermis terpisah dalam petridish baru Potongan dermis dan epidermis hasil inkubasi Suspensi Sel Larutan dispase I 2 mL - Disiapkan alat dan bahan seperti conical tube 15 mL, HBSS, trypsin 0,25, cawan petri, dan pipet tips 1000 µL. - Dipipet 3 mL HBSS, dituang ke dalam tube 15 mL + 2 mL trypsin. - Dipisahkan kulit dari lapisan dermis dan epidermis, dimasukkan ke dalam tube 15 mL dan dimasukkan inkubator selama 30 menit. - Setiap 5 menit dikocok-kocok sel sebanyak 10x hingga merata. - Larutan dalam inkubator tadi diinaktivasi dengan medium α MEM, PSAG 20, FBS sebanyak 5 mL, 1:1, dimasukkan ke dalam tube 50 mL. - Kemudian larutan ditriturasi homogenkandipipet naik turun dan saring dengan filter 70 µm pada tube 50 mL, lalu dibilas dengan HBSS sebanyak 5 mL. - Larutan dipipet dan dipindahkan ke tube 15 mL, disentrifuse 1500 rpm selama 20 menit. - Setelah itu larutan supernatan dibuang, endapan difliking dijentik-jentik, ditambahkan HBSS sebanyak 6 mL. - Larutan disentrifuse kembali dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit, - Suspensi sel ditriturasi dicampur dengan pipet 10 mL, dan sel siap dihitung dengan hemocytometer. - larutan HBSS 3 mL - tripsin 2 mL - medium kultur - Larutan HBSS Suspensi Sel Keratinosit Suspensi Sel fibroblast Perhitungan sel Keratinosit dengan hemocitometer Perhitungan sel Fibroblas dengan hemocitometer Universitas Sumatera Utara b. Tahap pergantian medium dan pasasi sel. Gambar 3.2 Bagan Kultur sel tahap isolasi - Suspensi sel fibroblas setelah dihitung, kemudian dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 37 o C, 5 CO 2 . - Medium sel diperiksa di bawah mikroskop, dilihat terdapat perubahan - Sel yang melekat di dasar dish kultur adalah sel yang hidup, sel yang berbentuk bulat-bulat, terang dan melayang adalah sel yang mati. - Disiapkan larutan PBS dan α - MEM. - Diambil cairan yang ada pada omnitray menggunakan pipet lalu buang. - Dicuci dengan PBS sebanyak 10 mL, digoyangkan omnitraynya, di buang lagi PBS nya. - Untuk sel fibroblas, digunakan medium α- MEM sebanyak 5 mL. - Digoyangkan perlahan-lahan, disimpan lagi ke dalam inkubator 37 o C, 5 CO 2 . - Medium diganti setiap 2-3 hari sekali. - Panen sel baru bisa dilakukan bila sel yang attach melekat didasar dish sudah mencapai 70-80. Suspensi Sel Fibroblast Suspensi Sel Fibroblast hasil inkubasi - larutan PBS - lar utan α - MEM - larutan PBS - larutan α - MEM Suspensi Sel konfluen 70-90 - larutan trypsin EDTA 500 µL1 mL Sel terlepas dari permukaan dish - larutan α MEM+20 FBS 500µL1 mL. Medium Sel Supernatan dibuang - Setelah itu supernatan dibuang, dilakukan fliking dengan jari pada bagian bawah tube. - Ditambahkan medium α MEM 500 µL. - Sel dihitung dengan sel counter. - Hasil inkubasi dikeluarkan dari inkubator, medium dibuang, sel dicuci dengan larutan PBSHBSS 500 µL1 mL. - Larutan trypsin EDTA 0,1 ditambahkan 500 µL1mL, diikubasi selama 10-15 menit. - Diamati pelepasan sel dari permukaan dish di bawah mikroskop. - Inaktivasi kerja enzyme dengan medium α MEM+20 FBS 500µL1 mL. Diamati pelepasan sel, jika masih ada yang menempel atau melekat triturasi lagi. - Medium sel dipindahkan ke dalam tube 15 mL, disentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 7 menit. Endapan Sel Medium α MEM 500 uL Gambar 3.3 Bagan tahap proses pergantian medium dan pasasi sel. Sel siap untuk ditransportasi atau ditransplantasi Universitas Sumatera Utara c. Kultur sel fibroblast manusia pada scaffold kitosan kolagen - Disiapkan dish 35mm, gunting, pinset, alkohol 70, dan larutan PBS. - Scaffold dipotong dengan ukuran 2x2 cm dengan gunting steril. - Dilakukan sterilisasi scaffold kitosan kolagen dengan mencuci dalam alkohol 70, diikuti dengan membilas dengan larutan PBS, diamkan hingga scaffold terendam ke dasar dish. Larutan PBS dibuang, dan diratakan permukaan scaffold diatas dish, inkubasi semalaman. Gambar 3.4 Bagan tahap kultur sel fibroblast manusia pada scaffold kitosankolagen Potongan Scaffold KitosanKolagen Scaffold KitosanKolagen Potongan Scaffold KitosanKolagen steril Potongan Scaffold KitosanKolagen hasil inkubasi - Alkohol 70 - PBS - Suspensi sel - Medium kultur Potongan Scaffold KitosanKolagen hasil inkubasi Perkembangan pertumbuhan sel diatas scaffold Mikroskop Inverted - Pipet suspensi sel 50.000-10.000 ke atas scaffold, 2 tetes, usahakan suspensi sel tidak turun dari permukaan scaffold, diamati di bawah mikroskop dan difoto. - Tambahkan medium kultur 2 ml hingga scaffold terendam seluruhnya, inkubasi, pengamatan dilanjutkan hingga hari ke-7. - Pengamatan pertumbuhan sel diatas scaffold pada hari 1-7. Setiap perubahan bentuk sel difoto dan Universitas Sumatera Utara

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Pembuatan scaffold kitosan-kolagen dilakukan dengan menggunakan freeze-dryer. Alat ini sering digunakan dalam sintesis scaffold atau modifikasi scaffold karena pengurangan kadar air dari bahan terjadi tanpa merusak struktur tiga dimensinya. Scaffold kitosan-kolagen yang diperoleh berbentuk seperti film transparan, lunak apabila terkena air dan menjadi kaku apabila dikeringkan. Untuk mengetahui karakteristik scaffold kitosan-kolagen, dilakukan analisis gugus fungsi dengan menggunakan FTIR, morfologi scaffold dengan SEM, uji termal dengan TGA dan uji pertumbuhan sel diatas scaffold dengan mikroskop inverted.

4.1 Uji FTIR

Spektra FTIR gabungan scaffold dari kolagen murni, kitosan murni, kitosankolagen, dan kitosankolagenGA, ditunjukkan pada Gambar 4.1. Interaksi antara bahan-bahan penyusun scaffold dapat diketahui dengan uji FTIR. Informasi pengaruh struktur dapat diketahui dalam analisis FT-IR menggunakan Spektrum Perkin Elmer GX FT-IR sistem. Scaffold dengan ketebalan sekitar 10 µM digunakan dalam tes inframerah. FT-IR analisis didasarkan pada identifikasi penyerapan pita yang bersangkutan dengan vibrasi gugus fungsional yang ditunjukkan dalam makromolekul. 4000 3000 2000 1000 Int ens itas - Bilangan Gelombang cm -1 Kitosan Kolagen Kitosankolagen KitosankolagenGA Universitas Sumatera Utara