12. Dipipet 3 mL HBSS, dituang ke dalam tube 15 mL + 2 mL trypsin. 13. Dipisahkan kulit dari lapisan dermis dan epidermis, dimasukkan ke dalam tube 15 mL
dan dimasukkan ke dalam inkubator selama 30 menit. 14. Setiap 5 menit dikocok-kocok sel sebanyak 10x hingga merata.
15. Larutan dalam inkubator tadi diinaktivasi dengan medium α MEM, PSAG 20,
FBS sebanyak 5 mL, 1:1, dimasukkan ke dalam tube 50 mL. 16. Kemudian larutan ditriturasi homogenkandipipet naik turun dan saring dengan filter
70 µm pada tube 50 mL, lalu dibilas dengan HBSS sebanyak 5 mL. 17. Larutan dipipet dan dipindahkan ke tube 15 mL, disentrifuse 1500 rpm selama 20
menit. 18. Setelah itu larutan supernatan dibuang, endapan difliking dijentik-jentik,
ditambahkan HBSS sebanyak 6 mL. 19. Larutan disentrifuse kembali dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit,
20. Suspensi sel ditriturasi dicampur dengan pipet 10 mL, dan sel siap dihitung dengan hemocytometer.
21. Cara perhitungan sel:
80 μLPBS + 10 μL trypan blue + 10 μL sel
……………….. 3.1 22. Sebelum sel dimasukkan ke dalam dish, terlebih dahulu dish dilapisi dengan kolagen,
dengan cara kolagen dimasukkan ke dalam dish, didiamkan selama 1 jam dalam inkubator.
23. Setelah itu, sel yang telah ditambahkan epilife dimasukkan ke dalam dish. 24. Kemudian dimasukkan ke dalam inkubator pada suhu 37
o
C, 5 CO
2
.
c. Pergantian medium
1. Medium sel diperiksa di bawah mikroskop, dilihat terdapat perubahan atau tidak. 2. Sel yang melekat di dasar dish kultur adalah sel yang hidup, sel yang berbentuk
bulat-bulat, terang dan melayang adalah sel yang mati. 3. Disiapkan larutan PBS dan epilife atau
α MEM. 4. Diambil cairan yang ada pada omnitray menggunakan pipet lalu dibuang.
5. Dicuci dengan PBS sebanyak 10 mL, omnitray digoyangkan, dibuang lagi PBS
Universitas Sumatera Utara
nya. 6. Untuk sel keratinosit, digunakan medium epilife sebanyak 5 mL.
7. Digoyangkan perlahan-lahan, disimpan lagi ke dalam inkubator 37
o
C, 5 CO
2
8. Medium diganti setiap 2-3 hari sekali. .
d. Pasasi sel panen sel
1. Panen sel baru bisa dilakukan bila sel yang attach melekat di dasar dish sudah mencapai konfluen 70-80.
2. Hasil inkubasi dikeluarkan dari inkubator, medium dibuang, sel dicuci dengan larutan PBSHBSS 500 µL1 mL.
3. Larutan trypsin EDTA 0,1 ditambahkan 500 µL1mL, diikubasi selama 10-15 menit.
4. Diamati pelepasan sel dari permukaan dish di bawah mikroskop. 5.
Inaktivasi kerja enzyme dengan medium α MEM+20 FBS 500µL1 mL. Diamati pelepasan sel, jika masih ada yang menempel atau melekat ditriturasi
lagi. 6. Medium sel dipindahkan ke dalam tube 15 mL, disentrifuse dengan kecepatan
1500 rpm selama 7 menit. 7. Setelah itu supernatan dibuang, dilakukan fliking dengan jari pada bagian bawah
tube. 8. Ditambahkan medium epilife 500 µL.
9. Sel dihitung dengan sel counter.
10. Sel siap untuk ditransportasi atau ditransplantasi.
e. Perhitungan sel dengan alat hemacytometer
1. Suspensi sel digoyangkan perlahan agar merata, masukkan 200 μL suspensi sel
dalam tube berisi 600 µL PBS lalu ditambahkan 200µL 0,1 trypan blue dan dikocok dengan membalikkan tube 3-5 kali.
2. Dibersihkan hemocytometer dan coverslip dengan tissue abrasive. 3. Disisipkan cover slip.
4. Dengan coverslip terpasang ditambahkan sejumlah kecil suspensi sel pada setiap ruangan dengan pipet pasteur, menggunakan daya kapilaritas, diusahakan tidak
berlebihan di bawah mikroskop cahaya.
Universitas Sumatera Utara
5. Digunakan mikroskop dengan perbesaran 10x-40x 6. Sel dihitung yang bright clear viable dan kebiruan non viable pada seluruh
ruangan 1mm
2
7. Dihitung jumlah sel viable dan non viable dengan rumus berikut: minimal, selesai dalam 5 menit setelah pencampuran trypan blue.
80 μLPBS + 10 μL trypan blue + 10 μL sel
………………… 3.2 A = rerata jumlah sel viable
B = rerata jumlah sel non-viable C = 5, faktor dilusi
10
4
AxCxD = Konsentrasi sel viable per mL = faktor koreksi.
BxCxD = Konsentrasi sel non viable Total jumlah sel viable = sel viable x vol
Total jumlah sel = jumlah sel viable + jumlah sel non viable Persentase viabilitas = jumlah sel viable x 100total jumlah sel.
Isolasi keratinosit menghasilkan jumlah sel berkisar 10
6
, kepadatan sel yang ditanam biasanya 20.000 selcm
2
.
f. Kultur sel fibroblast manusia pada scaffold kitosankolagen