5.2. Bahan dan Metode 5.2.1. Bahan
Ampas tapioka dan dua jenis karbon aktif KA1 dan KA2 yang digunakan pada penelitian ini sama dengan yang digunakan pada penelitian sebelumnya Bab
IV. Asam sulfat dan reagen lain yang digunakan mempunyai kualitas untuk analisis. Biakan Saccharomyces cerevisiae LIPI MC 0070 diperoleh dari Pusat
Penelitian Biologi – LIPI, Cibinong, Bogor.
5.2.2. Hidrolisis ampas tapioka menggunakan pemanasan gelombang mikro
Suspensi bahan dalam asam sulfat 0,88 4g20 mL atau 20 bv disiapkan di dalam tabung Teflon
®
berkapasitas 100 mL dan diaduk menggunakan pengaduk magnetik agar diperoleh suspensi yang homogen. Karbon aktif 0,4-2 g
atau 10-50 bb ditambahkan ke dalam contoh dengan perlakuan penambahan karbon aktif. Tabung Teflon
®
dan isinya diletakkan pada dudukannya yang berbentuk silinder dengan kapasitas 6 tabung. Campuran kemudian dihidrolisis
di dalam oven gelombang mikro SHARP R-360JS yang mempunyai frekuensi 2.450 MHz, daya output 1.100 W. Iradiasi dilakukan pada tingkat daya 50 atau
setara dengan 550 W selama 9 menit. Setelah iradiasi gelombang mikro, campuran dalam tabung segera didinginkan dengan merendamnya dalam bak
berisi es.
5.2.3. Analisis fraksi terlarut hidrolisat ampas tapioka
Kadar padatan terlarut dalam fraksi terlarut hidrolisat ampas tapioka ditentukan menggunakan ATAGO Hand Refractometer N-20. Kadar glukosa, pH,
absorbansi pada 490 nm dan kadar hidroksi metil furfural HMF ditentukan seperti pada Bab II, Bab III dan Bab IV, dengan metode seperti pada Lampiran 3.
5.2.4. Persiapan hidrolisat ampas tapioka untuk fermentasi
Hidrolisat yang disiapkan terdiri dari hidrolisat yang diperoleh tanpa penambahan karbon aktif dan dengan penambahan karbon aktif 1 g atau 25 dari
berat ampas tapioka pada proses hidrolisis. Hidrolisat dinetralkan dengan larutan ammonium hidroksida NH
4
OH 5 sampai pH mencapai 5,0-5,5. Hidrolisat
yang sudah dinetralkan dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi 50 mL. Menjelang fermentasi sebagian hidrolisat tanpa penambahan karbon aktif yang
telah dinetralkan diberi perlakuan karbon aktif dengan jenis dan jumlah yang sama dengan yang ditambahkan pada proses hidrolisis, yang bertujuan untuk
mengadsorpsi senyawa-senyawa inhibitor fermentasi. Proses adsorpsi inhibitor dilakukan di dalam waterbath shaker pada suhu 50 °C selama 30 menit. Dengan
demikian, ada lima hidrolisat yang disiapkan untuk fermentasi, yaitu hidrolisat tanpa penambahan karbon aktif H0, hidrolisat dengan penambahan karbon aktif
1 dan karbon aktif 2 pada saat hidrolisis H1A dan H2A, serta hidrolisat dengan penambahan karbon aktif 1 dan karbon aktif 2 setelah hidrolisis H1B dan H2B.
Diagram alir proses persiapan hidrolisat ampas tapioka disajikan pada Gambar 5.1.
Gambar 5.1 Diagram alir proses persiapan hidrolisat ampas tapioka sampai fermentasi.
Volume hidrolisat ditepatkan sampai 25 mL dengan air suling, lalu ditambahkan lagi 2 mL air suling. Sebagai referensi disiapkan larutan glukosa di dalam tabung
sentrifugasi 50 mL dengan konsentrasi yang hampir sama dengan konsentrasi glukosa di dalam hidrolisat ampas tapioka. Sebagian larutan glukosa diberi
Hidrolisis Asam Hidrolisis Asam
dan Adsorpsi Inhibitor
Adsorpsi Inhibitor
Fermentasi Ampas Tapioka
Karbon Aktif KA1, KA2
H0 H1A, H2A
H1B, H2B
Etanol Fermentasi
Fermentasi
Etanol Etanol
karbon aktif 1 g seperti pada hidrolisat ampas tapioka yang penambahannya dilakukan sebelum fermentasi. Selain itu, disiapkan pula larutan blanko substrat
yang berisi air suling sebagai pengganti hidrolisat ampas tapioka atau glukosa.
5.2.5. Persiapan inokulum S.cerevisiae
Biakan S. cerevisiae diinokulasikan pada medium agar miring PDA Potato Dextrose Agar, kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 5-7 hari.
Sebanyak 5 mL medium YPG pH 5 dengan komposisi yeast extract 10 gL, pepton 20 gL dan glukosa 50 gL yang telah disterilisasi dimasukkan ke dalam
medium agar miring yang telah ditumbuhi S. cerevisiae. Setelah itu, S. cerevisiae dirontokkan dan diinokulasikan ke dalam 25 mL medium YPG, kemudian
diinkubasi di dalam waterbath shaker pada suhu 30 °C selama 24 jam. Densitas optikal OD inokulum yang diperoleh diukur pada panjang gelombang 600 nm,
sedangkan penghitungan jumlah sel direct microscopic count dilakukan menggunakan haemocytometer. Pada penelitian ini diperoleh nilai OD 0,548 dan
jumlah sel 1,3 x 10
8
. Inokulum yang diperoleh siap untuk diinokulasikan ke dalam medium fermentasi, yaitu hidrolisat ampas tapioka dan larutan glukosa.
5.2.6. Fermentasi hidrolisat ampas tapioka dengan S. cerevisiae
Semua hidrolisat dan larutan glukosa yang telah disiapkan disterilisasi pada suhu 121 °C selama 15 menit, lalu didinginkan. Setelah itu, ke dalamnya
ditambahkan 3 mL inokulum S. cerevisiae, sehingga total volume hidrolisat, larutan glukosa maupun blanko substrat adalah 30 mL. Fermentasi dilakukan
pada gyratory shaker dengan kecepatan 150 rpm dan suhu ruang. Pengambilan contoh dilakukan setelah fermentasi berlangsung selama 24, 48, 72, 96 dan 120
jam. Hidrolisat H1A dan H1B diamati sampai jam ke 96 karena dari hasil penelitian pendahuluan glukosa di dalam kedua hidrolisat ini sudah habis setelah
inkubasi selama 72 jam. Hasil fermentasi disentrifugasi pada kecepatan 8.000 rpm, 5 °C selama 20 menit, lalu supernatan yang diperoleh dipisahkan dari
residunya. Selanjutnya, terhadap supernatan yang diperoleh dari hasil fermentasi dilakukan pengukuran pH menggunakan pH meter dan kadar total padatan terlarut
menggunakan ATAGO Hand Refractometer N-20, serta penentuan kadar glukosa
