gelombang pengamatan pada penelitian ini.Berikut adalah tabel panjang gelombang maksimum alopurinol hasil pengukuran.
Tabel VI. Panjang gelombang maksimum alopurinol hasil pengukuran
Konsentrasi gmL
maks
terukur Rata-rata
maks
terukur
5,0 272,9
273,7 ≈ 274 nm
7,5 273,9
10,0 273,7
12,5 274,0
15,0 273,8
Menurut Clarks 2005
maks
teoritis alopurinol sebesar 257 nm dalam NaOH 0,1 N namun dalam penelitian ini diperoleh rata-rata
maks
terukur sebesar 274 nmdalam pelarut amonium hidroksida 5 dalam metanol Tabel VI.
Perbedaan
maks
tersebut dapat disebabkan adanya perbedaan pelarut yang dipengaruhi oleh kepolaran pelarut sehingga mempengaruhi
maks
karena kepolaran molekul berubah jika suatu elektron bergerak dari satu orbital ke orbital
lainnya.Pengaruh pelarut biasanya mencapai hingga 20 nm Pecsok, 1968. Menurut perhitungan polaritas, NaOH 0,1 N memiliki indeks polaritas sebesar
10,2 sedangkan amonium hidroksida sebesar 5,4 Lampiran 8. Dalam pelarut polar NaOH 0,1 N transisi
suatu molekul memerlukan energi yang lebih besar dibandingkan pelarut yang kurang polar amonium hidroksida 5 dalam
metanol.Untuk selanjutnya digunakan panjang gelombang maksimum 274 nm.
b. Penentuan Fase Gerak
Pemisahan senyawa analit alopurinol menggunakan sistem KCKT fase terbalik, dimana fase gerak yang digunakan lebih polar dibandingkan dengan fase
diamnya. Fase diam yang digunakan yaitu oktadesilsilan C
18
dan fase gerak
yang digunakan adalah campuran metanol : amonium hidroksida 0,1dalam akuabides. Pada sistem KCKT fase terbalik ini, senyawa yang lebih polar akan
terelusi terlebih dahulu dibandingkan senyawa yang lebih nonpolar. Hal ini terjadi karena senyawa yang lebih polar akan lebih kuat untuk berinteraksi dengan fase
gerak dibandingkan dengan fase diam dan menyebabkan akan lebih mudah terelusi melewati fase diamnya, sedangkan senyawa yang bersifat lebih nonpolar
akan cenderung berinteraksi lebih kuat dengan fase diamnya sehingga akan tertinggal pada kolom lebih lama.
Gambar 11. Interaksi alopurinol dengan fase diam C
18
melalui interaksi van Der Waals
Gambar 12. Interaksi alopurinol dengan fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1 dalam akuabides melalui interaksi hidrogen
Pada penelitian ini, fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol p.a. dan akuabides yang ditambahkan dengan amonium hidroksida 0,1. Metanol
digunakan sebagai salah satu penyusun komposisi fase gerak karena metanol memiliki viskositas yang rendah yaitu 0,55 cp sehingga dapat menurunkan
tekanan pada kolom Gandjar dan Rohman, 2010. Penggunaan amonium hidroksida 0,1 sebagai campuran fase gerak ini bertujuan untuk mengurangi
interaksi alopurinol dengan gugus silanol pada C18 yang dapat mengakibatkan waktu retensi lebih lama dan peak tailing Snyder dkk., 2010.
Untuk mendapatkan kepolaran fase gerak yang sesuai, optimasi komposisi fase gerak dilakukan terhadap perbandingan metanol :amonium hidroksida 0,1
dalam akuabides yaitu 30:70; 20:80 dan 10:90. Pada penelitian ini dilakukan penurunan jumlah metanol secara bertahap. Menurut Snyder dkk. 1997, dengan
meningkatnya jumlah metanol dalam sistem KCKT fase terbalik maka analit akan terelusi lebih mudah. Namun hal tersebut tidak dilakukan, karena didalam sampel
terdapat banyak analit atau senyawa – senyawa yang terkandung, sehingga apabila dilakukan peningkatan metanol maka alopurinol sebagai analit yang akan
dianalisis dapat terelusi lebih cepat dan terpisah dengan analit lain. Akibatnya puncak alopurinol akan menumpuk dengan puncak lain dan menjadikan penelitian
ini menjadi tidak spesifik dan selektif.
Tabel VII. Perbandingan masing-masing komposisi fase gerak dan indeks polaritas
No. Komposisi Fase Gerak
′
=
Φ
.
′
+
Φ
.
′
Indeks Polaritas
Metanol + Akuabides amonium hidroksida 0,1
1. 10 : 90
0,1 x 5,1 + 0,9 x 10,2 9.69
2. 20 : 80
0,2 x 5,1 + 0,8 x 10,2 9,18
3. 30 : 70
0,3 x 5,1 + 0,7 x 10,2 8,67
Nilai indeks polaritas yang semakin besar akan menyebabkan fase gerak bersifat lebih polar. Alopurinol yang memiliki nilai polaritas sebesar 11,92
MarvinSketch merupakan senyawa yang bersifat polar. Berdasarkan prinsip like dissolve like, maka komposisi fase gerak metanol :amonium hidroksida 0,1
dalam akuabides10:90 dengan nilai indeks polaritas sebesar 9,69 dapat mengelusi alopurinol pada sistem KCKT ini.
Sistem elusi yang digunakan adalah sistem isokratik dimana tidak ada perubahan komposisi fase gerak selama proses elusi. Tujuan digunakannya sistem
isokratik karena peneliti ingin melihat respon pemisahan yang dapat dihasilkan oleh optimasi campuran fase gerak.Pencampuran kedua komposisi fase gerak
dilakukan di dalam instrumen KCKT. Komponen fase gerak harus disaring terlebih dahulu dengan menggunakan
kertas saring Whatmanukuran pori 0,45 m dengan bantuan pompa vakum untuk
menghilangkan adanya partikel-partikel kecil yang dapat menyumbat kolom sehingga dapat mempengaruhi analisis pada sistem KCKT. Kertas saring
Whatman yang digunakan untuk menyaring fase gerak terdapat dua macam yaitu kertas Whatman organik yang digunakan untuk menyaring larutan organik
metanol dan kertas Whatman anorganik untuk menyaring larutan anorganik akuabides.Selanjutnya fase gerak di degassing dengan menggunakan
ultrasonikator selama 15 menit yang bertujuan untuk menghilangan gelembung udara yang terdapat dalam fase gerak. Adanya gelembung udara yang terdapat
dalam fase gerak dapat mengakibatkan tekanan pada pompa menjadi tidak stabil sehingga mempengaruhi proses pembacaan sinyal dalam instrumen KCKT.
