Definisi dan Instrumentasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

pencampuran fase gerak tersebut dialirkan ke dalam kolom Snyder, Kirkland and Dolan, 2010. Pemilihan fase gerak dalam suatu metode pemisahan berdasarkan pada indeks polaritas P’ campuran fase gerak tersebut.Semakin besar nilai indeks polaritasnya menyatakan semakin polar fase gerak yang digunakan.Fase gerak yang sering digunakan merupakan kombinasi dari dua atau lebih campuran pelarut yang saling bercampur secara keseluruhan. Campuran fase gerak tersebut akan menghasilkan nilai polaritas tersendiri yang disebut indeks polaritas fase gerak Harvey, 2000. ′ = Φ . ′ + Φ . ′ 2 Keterangan, Φ A dan Φ B = fraksi volume pelarut pada pelarut A dan B P’ A dan P’ B = indeks polaritas pelarut pada pelarut A dan B Harvey, 2000. Tabel I. Indeks polaritas dan karakteristik solvent selectivity beberapa pelarut KCKT Snyder, Kirkland dan Dolan, 2010 Deret eluotropik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan panduan yang berguna dalam pemilihan fase gerak yang akan digunakan dalam KCKT. Deret eluotropik dapat dilihat pada tabel I. b. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sesuai dengan syarat wadah pelarut yaitu pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang sering digunakan untuk pompa yakni gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3mLmenit Rohman, 2009. Penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah agar dapat menjamin proses penghantaran fase gerak yang berlangsung dengan tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas gangguan Gandjar dan Rohman, 2010. Selain itu, pompa yang digunakan juga harus dapat menjamin akurasi dan konsistensi kecepatan alir dari fase gerak yang dibutuhkan untuk menjaga stabilitas dan ripitabilitas interaksi antara zat analit dengan fase diam. Kecepatan alir yang buruk dapat mempengaruhi waktu retensi dan resolusi pemisahan analit Chan et al., 2004. c. Tempat penyuntikan sampel Penyuntikan sampel pada KCKT dilakukan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir menuju kolom. Penggunaan syringe atau autosampler merupakan wadah yang digunakan dalam penyuntikan sampel Gandjar dan Rohman, 2010. Pada sistem KCKT, penyuntikan sampel melalui loop injectoryang dapat menyimpan volume dari 0,5 L – 2 mL. Pada posisi load, sampel diinjeksikan dan loop sampler terisolasi dari fase gerak. Kemudian ketika katup dipindahkan ke posisi loading posisi inject, injectorakan berpindah ke posisi inject dan saat itu fase gerak mengaliri sampel dan terbawa memasuki kolom Harvey, 2000. Gambar 3.Skema sampler KCKT. a posisi load, sampel diinjeksikan dan terisolasi dari fase gerak. b posisi inject, sampel terbawa fase gerak dan memasuki kolom Denney, 1993 d. Kolom Kolom merupakan bagian terpenting dalam rangkaian KCKT karena fase diam dalam KCKT terdapat dalam kolom.Dengan demikian, pemisahan analit dari komponen lainnya terjadi pada kolom.Keberhasilan pemisahan analit tergantung pada keadaan kolom, sehingga pemilihan kolom sangatlah penting Mulja dan Suharman, 1995. Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzene.Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol Si-OH. Modifikasi silika secara kimia akan menutupi gugus silanol dan menggantinya dengan guus fungsional lain. Hasil reaksi kimiawi tersebut akan menghasilkan silika yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan siloksan Si-O-Si. Hasil modifikasi tersebut memiliki karakter kromatografi dan selektivitas yang berbeda dengan gugus silanol bebas Gandjar dan Rohman, 2010. Oktadesilsilan ODS atau C 18 merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, dan tinggi. e. Detektor Terdapat dua golongan detektor pada KCKT yaitu detektor umum dan spesifik.Detektor umum merupakan detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat selektif dan spesifik. Contoh dari detektor umum adalah detektor indeks dan detektor massa. Detektor spesifik merupakan detektor yang hanya dapat mendeteksi suatu analit sesuai dengan spesifikasi tertentu, misalnya detektor UV-Vis, detektor fluoresensi dan elektrokimia.Penggunaan detektor spesifik, maka analit yang digunakan harus memiliki persyaratan yang sesuai untuk dapat dideteksi dengan detektor tersebut Rohman, 2009. Detektor Spektrofotometri UV-Vis Detektor UV-Vis merupakan detektor yang paling banyak digunakan karena hampir semua senyawa obat memiliki struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis. Sel detektor umumnya berupa tabung berdiameter 1 mm dan panjang celah optik 10 mm Gandjar dan Rohman, 2007. Senyawa yang dapat dideteksi dengan detektor UV-Vis ini adalah senyawa yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom serta memiliki serapan pada panjang gelombang UV dan Vis. Menurut Gandjar dan Rohman 2010, detektor pada KCKT memiliki beberapa karakteristik sebagai berikut : a. Respon terhadap analit cepat dan reprodusibel b. Mampu mendeteksi analit hingga kadar yang sangat kecil c. Stabil saat dioperasikan d. Memiliki sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita e. Sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran luas AUC f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

2. Optimasi Metode

Tahap optimasi merupakan serangkaian kondisi awal yang muncul pada tahap pengembangan metode dan harus dimaksimalkan dengan baik.Hal yang harus dimaksimalkan tersebut yaitu resolusi, bentuk puncak, jumlah lempeng, kapasitas, dan retention time Gandjar dan Rohman, 2010. Kecepatan alir yang optimal biasanya 0,8 mLmenit; 1,2 mLmenit; dan 2,5 mLmenit untuk kolom dengan diameter internal 4,6 mm dan ukuran partikel berkisar 3-10 m. Semakin kecil ukuran partikel akan menghasilkan pemisahan yang lebih cepat dan optimal Ahuja and Rasmussen, 2007.

3. Pemisahan Puncak Dalam Kromatografi

Karakteristik umum yang biasanya digunakan untuk mendeskripsikan kolom, sistem dan pemisahan kromatografi adalah faktor retensi k’, efisiensi N, selektivitas , dan resolusi R Ahuja and Rasmussen, 2007. a. Efisiensi kolom Tujuan umum kromatografi adalah memisahkan suatu campuran yang akan dianalisis. Kualitas pemisahan dengan kromatografi dapat dilihat berdasarkan 2 parameter, yakni resolusi dan efisiensi.Parameter resolusi yaitu tingkat pemisahan puncak-puncak analit yang saling berdekatan.Sementara parameter efisiensi yaitu ukuran banyaknya pelebaran puncak dari masing-masing puncak zat analit.Efisiensi pemisahan suatu kolom terdiri dari dua teori yaitu teori lempeng dan teori laju. i. Teori Lempeng Efisiensi merupakan karakteristik yang penting dalam kolom.Efisiensi diekspresikan sebagai jumlah lempeng teoritis N yang dihitung dengan persamaan sebagai berikut : = 16 3 Dimana, t R = retention time analit W = lebar peak pada posisi baseline Efisiensi kolom dalam kromatografi berkaitan juga dengan waktu retensi atau retention time, yakni lamanya waktu komponen atau molekul yang akan dianalisis berada di dalam kolom Gandjar dan Rohman, 2007. Pengukuran terhadap efisiensi kolom membutuhkan faktor lebar peak W karena waktu retensi berpengaruh terhadapnya, peningkatan nilai W akan meningkatkan retention time. Semakin tinggi jumlah lempeng teoritis pada suatu pemisahan menyatakan semakin baik pula efisiensi kolom, dan sebaliknya jika nilai lempeng teoritis yang didapatkan kecil, maka efisiensi kolom juga menurun Miller dan Crowther, 2010. Terdapat parameter lain terkait efisiensi kolom, yakni tinggi plat atau plate height H yang dirumuskan dengan persamaan berikut : = 4 Dimana, L merupakan panjang kolom. Tinggi plat H atau sering disebut tinggi plat teori HETP = Height Equivalent Theoretical Plate dalam kromatografi merupakan panjang kolom kromatografi dalam mm yang diperlukan sampai terjadinya satu kali keseimbangan molekul solute dalam fase gerak dan fase diam Gandjar dan Rohman, 2010. HETP dapat digunakan untuk membandingkan efisiensi kolom dengan panjang kolom yang berbeda karena pada pengukuran HETP ini, panjang kolom yang bervariasi dibandingkan dengan jumlah lempeng teoritis masing-masing kolom sehingga perbandingannya tidak berdasarkan masing-masing panjang kolom.Nilai HETP berbanding terbalik dengan jumlah lempeng teoritis N.Semakin tinggi nilai N maka semakin kecil nilai HETP dan semakin efisien kolom yang digunakan Gandjar dan Rohman, 2007. ii. Teori Laju Teori lempeng hanya menggambarkan laju migrasi secara kuantitatif, tetapi tidak dapat menggambarkan pengaruh variabel-variabel lain yang menyebabkan terjadinya pelebaran peak sehingga perlu diketahui teori laju.Pada waktu migrasi, zat analit mengalami transfer dalam fase diam dan fase gerak berulang-ulang.Zat analit hanya dapat bergerak jika berada dalam fase gerak sehingga migrasi di dalam kolom juga tidak teratur dan mengakibatkan laju rata- rata analit relatif terhadap fase gerak juga sangat bervariasi, sehingga terjadi pelebaran peak analit. Alasan timbulnya bentuk puncak dan pelebaran puncak didasarkan pada difusi Eddy, difusi longitudinal, dan transfer massa Snyder dkk., 2010. 1 Difusi Eddy Difusi Eddy mempresentatifkan faktor lain yang menyebabkan pelebaran pita. Molekul analit masuk ke dalam kolom melewati partikel fase diam dengan arah yang berbeda-beda menuju keluar kolom. Molekul yang bergerak lebih lambat akan keluar lebih lambat dan molekul yang bergerak lebih cepat akan keluar lebih dahulu. Pelebaran pita tidak tergantung pada kecepatan alir tetapi hanya bergantung dari penyusunan dan ukuran partikel dalam kolom. Pelebaran pita yang diakibatkan karena difusi Eddy akan semakin besar seiring dengan meningkatnya ukuran partikel dalam kolom Snyder dkk., 2010. Difusi Eddy dapat diminimalkan dengan memperkecil diameter rata-rata partikel dalam kolom hingga sekecil mungkin dan seseragam mungkin Willard et al., 1988. Gambar 4. Ilustrasi difusi Eddy saat memasuki kolom dan menyebabkan pelebaran pita Miller dan Crowther, 2010 2 Difusi longitudinal Difusi longitudinal menggambarkan pergerakan acak molekul dalam fase gerak.Difusi longitudinal berpengaruh secara signifikan terhadap ketinggian lempeng pada kecepatan fase gerak yang rendah atau lambat.Sedangkan pada kecepatan difusi solut yang tinggi dalam fase gerak menyebabkan molekul solut terdispers secara aksial dan lambat bermigrasi melalui kolom Willard et al., 1988. Gambar 5. Ilustrasi yang menyebabkan pelebaran puncak selama pemisahan menggunakan KCKT Snyder dkk., 2010 3 Transfer massa Transfer massa dapat menyebabkan pelebaran pita, terjadinya transfer massa disebabkan oleh transfer massa fase gerak yang merupakan kecepatan alir analit yang mempengaruhi pelebaran pita, diantara partikel fase diam terdapat