Spektrofotometri UV PENELAAHAN PUSTAKA
kuantifikasi zat analit.Rangkaian alat tersebut dikenal dengan instrumen kromatografi sebagai berikut.
Gambar 2. Skema Instrumentasi KCKT Gandjar dan Rohman, 2010
Menurut Gandjar dan Rohman 2010, instrumen KCKT pada dasarnya terdiri atas beberapa komponen yaitu : wadah fase gerak, sistem penghantaran
fase gerak, alat untuk memasukkan sampel tempat injeksi, kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung dan suatu komputer
atau integrator atau perekam peak.
a. Fase gerak
Sebelum digunakan, fase gerak harus dilakukan penyaringan terlebih dahulu untuk menghilangkan partikel kecil yang mungkin ada sebagai pengotor
karena dapat menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi.Partikel pengotor yang terkumpul pada kolom atau selang penhubung dapat menimbulkan
penyumbatan.Selain itu, fase gerak juga harus di degassing terlebih dahulu untuk menghilangkan gelembung atau gas yang terdapat pada fase gerak, adanya
gelembung atau gas tersebut yang berkumpul pada detektor dapat mengacaukan
analisis.Saat pembuatan fase gerak, dianjurkan untuk menggunakan fase gerak dengan kemurnian yang tinggi agar tingkat pengotor yang ada rendah dan tidak
mengacaukan sistem kromatografi Gandjar dan Rohman, 2010. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri dari campuran pelarut yang dapat
bercampur dan berperan dalam daya elusi dan resolusi.Daya elusi dan resolusi tersebut ditentukan berdasarkan polaritas keseluruhan pelarut fase gerak, polaritas
fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.Terdapat dua fase yang biasanya digunakan dalam sistem KCKT yaitu fase normal dan fase diam.
Penentuan kedua fase ini tergantung pada tingkat kepolaran dari masing-masing fase gerak dan fase diam yang digunakan.Jika fase diam yang digunakan bersifat
lebih polar dibandingkan fase geraknya maka disebut fase normal.Pada KCKT fase normal, kemampuan elusi senyawa nonpolar meningkat dengan
meningkatnya polaritas pelarut.Sedangkan untuk fase terbalik fase diam kurang polar dibandingkan fase gerak.Kemampuan elusi senyawa nonpolar menurun
dengan meningkatnya polaritas pelarut Rohman, 2009. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik komposisi fase gerak tetap
selama elusi atau dengan cara gradien komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi. Metode isokratik merupakan metode pencampuran fase gerak
secara manual dengan tangan dan saat memasuki sistem KCKT tidak dibutuhkan adanya pencampuran fase gerak kembali dan dilakukan dengan satu
pompa.Metode gradien merupakan metode pencampuran fase gerak yang dilakukan di dalam sistem KCKT, menggunakan beberapa pompa untuk
memompa pelarut ke dalam wadah pencampuran fase gerak dan hasil
pencampuran fase gerak tersebut dialirkan ke dalam kolom Snyder, Kirkland and Dolan, 2010.
Pemilihan fase gerak dalam suatu metode pemisahan berdasarkan pada indeks polaritas P’ campuran fase gerak tersebut.Semakin besar nilai indeks
polaritasnya menyatakan semakin polar fase gerak yang digunakan.Fase gerak yang sering digunakan merupakan kombinasi dari dua atau lebih campuran pelarut
yang saling bercampur secara keseluruhan. Campuran fase gerak tersebut akan menghasilkan nilai polaritas tersendiri yang disebut indeks polaritas fase gerak
Harvey, 2000. ′
=
Φ
.
′
+
Φ
.
′
2
Keterangan, Φ
A
dan Φ
B
= fraksi volume pelarut pada pelarut A dan B P’
A
dan P’
B
= indeks polaritas pelarut pada pelarut A dan B Harvey, 2000.
Tabel I. Indeks polaritas dan karakteristik solvent selectivity beberapa pelarut KCKT Snyder, Kirkland dan Dolan, 2010