Bahan dan Alat METODOLOGI

Selanjutnya, perendaman dengan akuades yang kedua dan ketiga dilakukan dengan memindahkan gelas objek ke dalam wadah berbentuk kotak yang di bagian dasarnya terdapat tisu yang dibasahi dengan akuades. Pada bagian atas tisu tersebut diberi dua penyangga untuk meletakkan gelas objek agar tidak langsung menyentuh tisu yang basah tersebut. Dalam kondisi tersebut, proses perendaman jaringan dilakukan dengan meneteskan akuades melalui pipet tetes tepat di atas jaringan. Perendaman jaringan dilanjutkan di dalam larutan 3 H 2 O 2 dengan cara diteteskan. Perendaman ini dilakukan selama 10 menit. Setelah itu, perendaman dilakukan di dalam akuades lagi dengan cara diteteskan tepat di atas jaringan. Perendaman ini dilakukan sebanyak dua kali, masing-masing selama 5 menit. Perendaman dilanjutkan di dalam larutan PBS phosphate buffer saline selama 5 menit. Dalam hal ini, PBS berperan sebagai larutan pencuci wash buffer. PBS dibuat dengan cara melarutkan tablet PBS ke dalam akuades, dengan perbandingan satu tablet PBS dilarutkan dalam 200 ml akuades. Pada saat pembuatan PBS, ditambahkan Tween 20 sebanyak satu tetes. Tween 20 berperan sebagai deterjen, yaitu untuk menyatukan antara PBS dengan protein target. Tween 20 juga dapat membersihkan protein-protein lain yang bukan target, sehingga memperjelas pengamatan protein target. Perendaman dilanjutkan di dalam larutan blocking blocking solution selama satu jam. Larutan blocking dibuat dengan cara melarutkan susu skim skim milk ke dalam PBS, dengan perbandingan 0,1 g susu skim dilarutkan dalam 100 ml PBS. Perendaman dengan larutan blocking dilakukan dengan cara diteteskan tepat di atas jaringan. Volume larutan blocking yang dapat diteteskan adalah 100- 400 μL pada suhu ruang. Penetesan larutan blocking dilakukan dengan mikropipet. Perendaman selanjutnya adalah perendaman jaringan dalam larutan antibodi primer dengan proses inkubasi pada suhu 4°C suhu kulkas selama semalam overnight. Perendaman dengan antibodi primer dilakukan dengan cara diteteskan tepat di atas jaringan, sebelum diinkubasi dengan suhu 4°C. Volume larutan antibodi primer yang diteteskan adalah 100-40 0 μL dengan pengenceran 1:150 antibodi anticaspase-3 dan pengenceran 1:30 antibodi antiCD4 Penetesan larutan antibodi primer dilakukan dengan mikropipet. Perendaman ini bertujuan mengefektifkan reaksi antara antigen yang terdapat pada jaringan dengan antibodi primer reaksi Ag-Ab. Setelah overnight, larutan antibodi primer dicuci dan dilanjutkan dengan merendam jaringan dalam larutan PBS sebanyak tiga kali, masing- masing selama 5 menit. Dalam hal ini, larutan PBS diteteskan saja. Perendaman selanjutnya adalah perendaman jaringan dalam larutan antibodi sekunder dengan proses inkubasi pada suhu ruang selama 30 menit. Perendaman dengan antibodi sekunder dilakukan dengan cara diteteskan tepat di atas jaringan. Volume larutan antibodi sekunder yang diteteskan adalah 100- 400 μL dengan pengenceran 1:1000. Penetesan larutan antibodi sekunder dilakukan dengan mikropipet. Perendaman ini bertujuan mengefektifkan reaksi antara antibodi primer yang sudah terikat pada jaringan dengan antibodi sekunder reaksi Ag-Ab. Pada penelitian ini, antibodi sekunder yang digunakan adalah antibodi antirabbit yang dilabel dengan enzim HRP horseradish peroxidase. Setelah itu, larutan antibodi sekunder dicuci, dilanjutkan dengan merendam jaringan dalam larutan PBS sebanyak tiga kali, masing-masing selama 5 menit. Selanjutnya, jaringan direndam dengan larutan DAB diaminobenzidine. Dalam hal ini, DAB harus disiapkan dalam keadaan segar. DAB dibuat dengan mengencerkan larutan stok DAB dalam pelarut DAB dengan perbandingan 1:10. DAB merupakan substrat bagi enzim HRP yang melabel antibodi sekunder. Reaksi antara DAB dan enzim HRP menghasilkan warna coklat. Selanjutnya, larutan DAB dicuci dari jaringan dengan merendam jaringan dalam akuades selama 5 menit. Setelah itu, jaringan direndam dengan larutan hematoksilin selama 5-10 menit. Hematoksilin merupakan salah satu pewarna yang baik untuk diagnosis histopatologik, karena hematoksilin berperan mewarnai nukleus dan jaringan terkalsifikasi dengan warna ungu. Perendaman berlanjut dengan merendam jaringan dalam akuades sebanyak dua kali, masing-masing 5 menit. Setelah perendaman